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SAP-Garnele-alkalische Phosphatase-Protokoll

Garnele alkalische Phosphatase oder SAP, ist ein Enzym, das die Dephosphorylierung von 5 ' Phosphaten von Nukleinsäure dephosphorylating RNS- oder DNA-Enden katalysiert.

Beachten Sie, dass PCR-Produkte und auch Zündkapseln nicht Phosphatasen an ihren freien Enden haben, und müssen Sie folglich vor Klonen phosphoryliert sein, wenn Sie einen de-phosphorylated Vektor verwenden werden!

SAP ist die instabile Temperatur sind folglich Sie kann dieses Enzym leicht entaktivieren (verglichen mit CIP!). SAP wird mit Ausbrütung des Wasserbads 65°C für 15 Minuten entaktiviert.

Sie erhalten praktisch keine Reaktion. SAP fordert mindestens das 10mM MgCl2 (aber optimale Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase der Garnele ist bei dem 20-25mM MgCl2) und es funktioniert gut bei pH 8.0.

Zu dephosphorylate 1 pmol der DNA-Enden

Zu dephosphorylate 1 pmol der DNA-Enden (2.5 ug des 3-Kb-Plasmids), denn 1hr an 37°C, das Sie benötigen:


0.1 Maßeinheiten von SAP für 5 ' Überhänge, 0.2 Maßeinheiten für stumpfes und 0.5 Maßeinheiten für 3 ' hängt vorbei.
Enzym kommt 1 Maßeinheit pro UL, so, sicher kann zu sein Sie Maßeinheiten approx.0.5 für 2 ug benutzen.

SPITZEN: SAP-Enzym kann direkt Beschränkungsauswahl hinzugefügt werden! So kann das vollständige Verfahren einschließlich die Beschränkungsenzymverdauung, Dephosphorylierung, Enzyminaktivierung, Verbindung oder 5 ', die Ende-beschriften, in einem einzelnen Gefäß durchgeführt werden, indem man gerade die passenden Reagenzien hinzufügt. Dieses erlaubt Ihnen, Zeit zu sparen und leistungsfähig zu sein!

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