Beschränkungs-Enzym-Verdauung

Beschränkungs-Enzyme

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Molekulare Station ©2006. Aktualisiertes Juli 2008.

Informationen über, wie man ein Experte auf Beschränkungs-Enzymen und verdauen DNA wird!

Hintergrund auf Beschränkungs-Enzymen

Beschränkungsenzyme (oder Beschränkung Endonucleases) sind Enzyme, die double-stranded DNA schneiden, indem sie zwei Brüche bilden, eins durch jedes des Phosphatrückgrats der doppelten Schnecke. Das Enzym tut dies, ohne die Unterseiten der DNA zu schädigen. Obgleich das Enzym die DNA bricht, können die chemischen Bindungen durch andere Enzyme verbessert werden, die als DNAligases bekannt sind. Folglich können Beschränkungsfragmente von DNA von den verschiedenen Chromosomen oder von den Genen zusammen verbunden werden und ihre Enden zur Verfügung stellen, sich ergänzen.

Verwendungsfähigkeit der Beschränkungs-Enzyme in der Molekularbiologie

Die Tatsache, dass DNA manipuliert werden könnte und die verschiedenen DNA-Stücke konnten jetzt zusammen nie verbunden werden, erschlossene neue Bereiche der Forschung, vor vorgestellt worden. Viele der Methoden in der Molekularbiologie beruhen heute auf Beschränkungsenzymen. „Beschränkung“ wird von der Tatsache berechnet, dass diese Enzyme initally in Escherichia Coli entdeckt wurden, die schien, die Infektion der spezifischen Bakteriophagen („Viren“ des Bakteriums) einzuschränken. Es wird geglaubt, dass Beschränkungsenzyme ein HauptrechnerAbwehrmechanismus sind, der durch Bakterium entwickelt werden und andere Organismen, um Vireninfektion zu widerstehen, und bei der Beseitigung von Virenreihenfolgen zu helfen.

1978 wurde der Nobelpreis für Medizin nach Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Smith für ihre Entdeckung von Beschränkung Endonucleases zugesprochen, die zu die Entwicklung der recombinant DNA-Technologien führen. Der erste praktische Gebrauch der Beschränkungsenzyme in der Wissenschaft und in der Medizin war die Handhabung des Escherichia- Colibakteriums, zum des recombinant menschlichen Insulins für Diabetiker auszudrücken.

Beschränkungs-Enzymen handhaben und mit

Eine Maßeinheit der BeschränkungsEnzymaktivität wird durch die Menge des restrition Enzyms benötigt, um 1 Mikrogramm Bakteriophagelambda DNA zur Beendigung in einer Zeit von 1 Stunde zu schneiden definiert.

Die Proben entwickelt durch den Hersteller der Enzyme sind erfolgt unter Verwendung in hohem Grade gereinigter DNA (d.h. Plasmide oder Lambda Bakteriophagen-DNA) als Substrat höchstwahrscheinliches, und Probe bedingt, die die besten Resultate mit ihrer bestimmten Vorbereitung liefern. Häufig sind- die Laborzustände nicht als Ideal, und ein geringfügiger Überfluss des Enzyms oder des längeren Ausbrütungzeitraums wird verwendet, um zu helfen, komplette Verdauung sicherzustellen.

Es gibt viele „Universal“ Enzymbuffer, die mit einer Vielzahl der Enzyme arbeiten, aber häufig genügen sie nicht den leistungsfähigsten Anforderungen für irgendein ein Enzym. Weil die Universalbuffer nicht sind, wie leistungsfähig, empfehlen wir nicht ihren Routinegebrauch im Labor (besonders für kompliziertes genomic DNAs; Auswahl von kompliziertem genomic DNAs sind normalerweise bei hohen DNA-Konzentrationen, die das Enzym hemmen; auch die verhältnismäßig groben DNA-Vorbereitungen können Hemmnisse enthalten, das mehr Maßeinheitsenzym ard längere Ausbrütungzeiten für komplette Verdauung benötigt). Es ist immer am besten, die empfohlenen Probenzustände des Herstellers für restricition Verdauung zu verwenden. Vor der Anwendung einige Hersteller haben Enzyme, die sehr verschiedene Anforderungen von anderen Versionen des gleichen Enzyms haben, also überprüfen geklont. Enzymkonzentrationen werden immer auf der Seite des Enzymgefäßes gegeben. Die Beschränkungsenzyme, die im Labor benutzt werden, werden immer bei -20 Grad C (in einer Glyzerinunterseite) gespeichert, und sollten zu -20 Grad C so nah gehalten werden, wie möglich, die Lebensdauer des Enzyms auszudehnen. Wenn Sie Auswahl installieren, holen Sie das Reaktionsgefäß zur Enzymgefriermaschine in einer Eiswanne; löschen Sie das Enzymgefäß von der Gefriermaschine und halten Sie das Gefäß auf Eis beim Arbeiten mit dem Enzym. Bringen Sie sofort das Gefäß zur Gefriermaschine zurück, wenn Sie beendet werden. Verwenden Sie das pipetmen, das für nur Beschränkungsenzyme gekennzeichnet wird und verwenden Sie immer eine neue pipetman Spitze, wenn Sie Enzym vom auf lagergefäß löschen.

Spitzen auf Beschränkungs-Enzym-Verbrauch

• Alles Herstellers der Beschränkungsenzyme liefern spezifische Buffer mit den Enzymen, und diese sollten in der -20°C Gefriermaschine gespeichert werden. Beschränkungs-Enzyme sollten an -20°C. auch gespeichert werden.
• Bilden Sie nie Beschränkungsauswahl mit dem Beschränkungsenzym, das mehr als 1/10 des abschließenden Datenträgers besteht. Dieses liegt an der Tatsache, dass die BeschränkungsEnzymproteine im Glyzerin gespeichert werden. Bei Konzentrationen über 10%, hemmt Glyzerin nicht nur, die Verdauung aber kann Sternaktivität auch verursachen - führend zu die anomalen, unspezifischen Schnitte der DNA.
• Installieren Sie eine Steuerauswahl, wenn Sie Beschränkungsenzyme verwenden. Dieses hilft Ihnen, zu wissen, wenn das Enzym richtig arbeitet und Sie die Reaktion gut aufstellen. Benutzen Sie eine Plasmid DNA, die bekannte Zerteilungmuster festlegt.
• Wenn Sie doppelte Enzymauswahl vorbereiten, stellen Sie das Salzgehalt der Buffer fest. Leiten Sie Beschränkungsverdauung unter Verwendung des Enzyms mit den niedrigeren Salzanforderungen ZUERST, dann benutzen Sie das zweite Enzym, indem Sie den Buffer des Reaktionsgefäßes auf die zweite optimale Salzkonzentration justieren.
• DNA-Vorbereitungen können Verunreinigungen haben, die Beschränkungsenzym-Verdauungaktivität hemmen können. Einige DNA-Lokalisierungsinstallationssätze sogar benutzen hohe EDTA-Buffer, um die DNA zu eluieren. Dieses ist für DNA-Speicher okay, aber hohe Konzentrationen von EDTA können Beschränkungsverdauung hemmen. PCR reinigen Ihre DNA und eluieren mit TE oder wässern, wenn Ihre Enzymaktivität aber Ihre DNA-Blicke o.k. gehemmt wird. Sie konnten Mg2+ der Reaktion auch hinzufügen und sehen wenn dieses Hilfen auch.
• Wenn Sie komplette Beschränkungsverdauung Ihrer DNA erreichen können nicht, nachdem Sie Extraenzym hinzugefügt haben, installieren Sie eine neue Auswahl und fügen Sie spermidine einer abschließenden Konzentration von 2 Millimeter hinzu.

Beschränkungs-Enzym-Verdauung von DNA

Analytisch gegen vorbereitende Beschränkungs-Enzym-Verdauung

Normalerweise wird DNA-Verdauung in UL 25 - 50 (Mikroliter) geleitet, wenn Sie gerade Ihre DNA überprüfen oder analysieren möchten. Diese werden analytische Beschränkungsenzymverdauung genannt.

Ein kann 0.25 bis 2 ug (Mikrogramme) für analytische Vorbereitungen verdauen. Dieses ist, weil auf einem Agarose minigel (30ml), man .05ug (50 ng, nanograms) pro Band ungefähr sichtbar machen kann. Sichtbarmachung eines Bandes hängt von der Länge der DNA und von der Menge des DNA-Geschenkes ab. Im Allgemeinen ist das länger die DNA vorhanden im Band, das einfachere sind zu sehen.

DNA-Verdauung vieler Mikrogramme und höheren Datenträger von 50 - UL 500 (Mikroliter) oder mehr sind vorbereitend und bedeuten, dass Sie DNA-Fragmente für folgende Reinigung vorbereiten und klonen.

Beschränkungs-Verdauung des DNA-Protokolls

Rezept für Beschränkungs-Enzym-Verdauung:

Analytisch

Sie konnten Mg2+ der Verdauungreaktion hinzufügen (in Form von MgCl) wenn Sie ein umfangreiches von DNA verwenden. Sie sollten dies tun, besonders wenn der Buffer Sie Ihre DNA in enthaltenem EDTA eluierten. Dieses ist, weil, wenn „X“ groß ist, IE > 20ul Datenträger, Sie Magnesium hinzufügen müssen kann. EDTA bindet an 4 Molen Magnesium für jede Mole von EDTA. So bindet DNA in einer 1 Millimeter-(milimolar) Lösung von EDTA 4mM von Magnesium. Ein guter ungefährer Richtwert ist, 1 1ul von 10mM MgCl jedem 20ul von DNA hinzuzufügen.

Vorbereitend

Brüten Sie an 37°C 1 - 3 Stunden lang aus.

1 Maßeinheit ist genügend Enzym zu ug digest1 DNA mindestens in 1 Stunde. Verdauen 3 Stunden lang konnten Sie höhere Mengen DNA verdauen. Da Sie 10-20 Maßeinheiten Enzym hinzufügen, konnten Sie 10ug von DNA in 1 Stunde sogar verdauen! Enzyme sind vergeuden sie nicht unnötig teuer!

Anmerkungen über Beschränkungs-Enzym-Verbrauch:

• Halten Sie Enzyme kalt.
• Halten Sie immer Beschränkungsenzyme auf Eis!
• Setzen Sie die Zeit herab, die Sie Beschränkungsenzyme auf Eis haben. Sie können dies leicht tun, indem Sie eine Kühlbox kaufen (die im Allgemeinen ein Block des Metalls ist, das, Sie Ihre Enzyme innen halten)

Referenzen:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. und T. Maniatis. (1989) Molekulares Klonen, ein Laborhandbuch. Zweite Ausgabe. Kalte Frühlings-Hafen-Laborpresse. pp. 5.3 - 5.32.

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