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Beschränkung Enzym-Verdauung

Beschränkung Enzyme

©Molekulare Station 2006

Informationen über, wie man ein Experte auf Beschränkung Enzymen und verdauen DNA wird!

Hintergrund auf Beschränkung Enzymen

Beschränkung Enzyme (oder Beschränkung Endonucleases) sind Enzyme, die double-stranded DNA schneiden, indem sie zwei Brüche bilden, eins durch jedes des Phosphatrückgrats der doppelten Schnecke. Das Enzym tut dies, ohne die Unterseiten der DNA zu beschädigen. Obgleich das Enzym die DNA bricht, können die chemischen Bindungen durch andere Enzyme verbessert werden, die als DNA Ligases bekannt sind. Folglich können die Beschränkung Fragmente von DNA von den unterschiedlichen Chromosomen oder von den Genen zusammen verbunden werden und ihre Enden zur Verfügung stellen, sind ergänzend.

 

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Verwendungsfähigkeit der Beschränkung Enzyme in der molekularen Biologie

Die Tatsache, daß DNA manipuliert werden könnte und die unterschiedlichen DNA Stücke konnten jetzt zusammen nie verbunden werden, erschlossene neue Bereiche der Forschung, vor vorgestellt worden. Viele der Methoden in der molekularen Biologie beruhen heute auf Beschränkung Enzymen. "Beschränkung" wird von der Tatsache berechnet, daß diese Enzyme initally in E. Coli entdeckt wurden, das schien, die Infektion der spezifischen Bakteriophagen ("Viren" des Bakteriums) einzuschränken. Es wird geglaubt, daß Beschränkung Enzyme ein Hauptrechnerabwehrmechanismus sind, der durch Bakterium entwickelt werden und andere organismen, um Vireninfektion zu widerstehen, und bei der Beseitigung von Virenreihenfolgen zu helfen.

1978 wurde der Nobelpreis für Medizin nach Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Smith für ihre Entdeckung von Beschränkung Endonucleases zugesprochen, die zu die Entwicklung der recombinant DNA Technologien führen. Der erste praktische Gebrauch der Beschränkung Enzyme in der Wissenschaft und in der Medizin war die Handhabung E. Coli des Bakteriums, zum des recombinant menschlichen Insulins für Diabetiker auszudrücken.

Beschränkung Enzymen handhaben und mit

Eine Maßeinheit der Beschränkung Enzymaktivität wird durch die Menge des restrition Enzyms benötigt, um 1 Mikrogramm Bakteriophagelambda DNA zur Beendigung in einer Zeit von 1 Stunde zu schneiden definiert.

Die Proben entwickelt durch den Hersteller der Enzyme sind erfolgt mit in hohem Grade gereinigter DNA (d.h. Plasmide oder Lambda Bakteriophagen-DNA) als Substrat wahrscheinlichstes, und Probe bedingt, die die besten Resultate mit ihrer bestimmten Vorbereitung produzieren. Häufig sind- die Laborzustände nicht, wie ideal, und ein geringfügiger Überfluß des Enzyms oder der längeren Ausbrütungperiode wird verwendet, um zu helfen, komplette Verdauung sicherzustellen.

Es gibt viele ' Universal' Enzymbuffer, die mit einer Vielzahl der Enzyme arbeiten, aber häufig entsprechen sie nicht den leistungsfähigsten Anforderungen für irgendein ein Enzym. Weil die Universalbuffer nicht sind, wie leistungsfähig, empfehlen wir nicht ihren Routinegebrauch im Labor (besonders für kompliziertes genomic DNAs; Auswahl von kompliziertem genomic DNAs sind normalerweise bei hohen DNA Konzentrationen, die das Enzym hemmen; auch die verhältnismäßig groben DNA Vorbereitungen können Hemmnisse enthalten, das mehr Maßeinheiten Enzym ard längere Ausbrütungzeiten für komplette Verdauung benötigt). Es ist immer am besten, die empfohlenen Zustände Probe des Herstellers für restricition Verdauung zu verwenden. Einige Hersteller haben Enzyme, die sehr unterschiedliche Anforderungen von anderen Versionen des gleichen Enzyms haben, also überprüfen geklont, bevor sie verwendeten. Enzymkonzentrationen werden immer auf der Seite des Enzymgefäßes gegeben. Die Beschränkung Enzyme, die im Labor benutzt werden, werden immer bei -20 Grad C (in einer Glycerinunterseite) gespeichert, und sollten wie nah an -20 Grad C gehalten werden, wie möglich, die Lebensdauer des Enzyms auszudehnen. Wenn Sie Auswahl aufstellen, holen Sie das Reaktion Gefäß zur Enzymgefriermaschine in einer Eiswanne; löschen Sie das Enzymgefäß von der Gefriermaschine und halten Sie das Gefäß auf Eis beim Arbeiten mit dem Enzym. Bringen Sie sofort das Gefäß zur Gefriermaschine zurück, wenn Sie beendet werden. Verwenden Sie pipetmen gekennzeichnet für nur Beschränkung Enzyme und verwenden immer eine frische pipetman Spitze, wenn Sie Enzym vom auf lagergefäß löschen.

Spitzen auf Beschränkung Enzym-Verbrauch

• Alles Herstellers der Beschränkung Enzyme geben spezifische Buffer mit den Enzymen an, und diese sollten in der -20°C Gefriermaschine gespeichert werden. Beschränkung Enzyme sollten an -20°C auch gespeichert werden.
• Bilden Sie nie Beschränkung Auswahl mit dem Beschränkung Enzym, das mehr als 1/10 aus dem abschließenden Datenträger besteht. Dieses liegt an der Tatsache, daß die Beschränkung Enzymproteine im Glycerin gespeichert werden. Bei Konzentrationen über 10%, hemmt Glycerin nicht nur, die Verdauung aber kann Sternaktivität auch verursachen - führend zu die anomalen, unspezifischen Schnitte der DNA.
• Stellen Sie eine Steuerauswahl auf, wenn Sie Beschränkung Enzyme verwenden. Dieses hilft Ihnen, zu wissen, wenn das Enzym richtig arbeitet und Sie die Reaktion gut aufstellen. Benutzen Sie eine Plasmid DNA, die bekannte Zerteilungmuster festlegt.
• Wenn Sie doppelte Enzymauswahl vorbereiten, stellen Sie das Salzgehalt der Buffer fest. Leiten Sie Beschränkung Verdauung mit dem Enzym mit den niedrigeren Salzanforderungen ZUERST, dann benutzen Sie das zweite Enzym, indem Sie den Buffer des Reaktion Gefäßes auf die zweite optimale Salzkonzentration justieren.
• DNA Vorbereitungen können Verunreinigungen haben, die Beschränkung Enzym-Verdauungaktivität hemmen können. Einige DNA Lokalisierung Installationssätze benutzen sogar hohe EDTA-Buffer, um die DNA zu eluieren. Dieses ist für DNA Speicher okay, aber hohe Konzentrationen von EDTA können Beschränkung Verdauung hemmen. PCR reinigen Ihre DNA und eluieren mit TE oder wässern, wenn Ihre Enzymaktivität aber Ihre DNA Blicke o.k. gehemmt wird. Sie konnten Mg2+ der Reaktion auch hinzufügen und sehen wenn dieses Hilfen auch.
• Wenn Sie nicht die komplette Beschränkung Verdauung Ihrer DNA erreichen können, nachdem Sie Extraenzym hinzugefügt haben, aufgestellt einer neuen Auswahl und spermidine einer abschließenden Konzentration von 2 Millimeter hinzufügen.

Beschränkung Enzym-Verdauung von DNA

Analytisch gegen vorbereitende Beschränkung Enzym-Verdauung

Normalerweise wird DNA Verdauung in UL 25 - 50 (Mikroliter) geleitet, wenn Sie gerade Ihre DNA überprüfen oder analysieren möchten. Diese werden analytische Beschränkung Enzymverdauung genannt.

Ein kann 0.25 bis 2 ug (Mikrogramme) für analytische Vorbereitungen verdauen. Dieses ist, weil auf einem Agarose minigel (30ml), man 05ug (50 ng, nanograms) pro Band ungefähr sichtbar machen kann. Sichtbarmachung eines Bandes hängt von der Länge der DNA und von der Menge des DNA Geschenkes ab. Im allgemeinen ist das länger die DNA vorhanden im Band, das einfachere sind zu sehen.

DNA Verdauung vieler Mikrogramme und höherer Datenträger von 50 - UL 500 (Mikroliter) oder mehr sind vorbereitend und bedeuten, daß Sie DNA Fragmente für folgende Reinigung vorbereiten und klonen.

Beschränkung Verdauung des DNA Protokolls

Rezept für Beschränkung Enzym-Verdauung:

Analytisch

Sie konnten Mg2+ der Verdauungreaktion hinzufügen (in Form von MgCl) wenn Sie einen großen Datenträger DNA benutzen. Sie sollten dies tun, besonders wenn der Buffer Sie Ihre DNA in enthaltenem EDTA eluierten. Dieses ist, weil, wenn "X" groß ist, IE > 20ul Datenträger, Sie Magnesium EDTA-Bindungen 4 Molen Magnesium für jede Mole von EDTA hinzufügen müssen kann. So bindet DNA in einer 1 Millimeter (milimolar) Lösung von EDTA 4mM von Magnesium. Ein guter ungefährer Richtwert soll 1 1ul von 10mM MgCl jedem 20ul von DNA hinzufügen.

Vorbereitend

Brüten Sie an 37°C 1 - 3 Stunden lang aus.

1 Maßeinheit ist genügend Enzym zu ug digest1 DNA mindestens in 1 Stunde. Verdauen 3 Stunden lang konnten Sie höhere Mengen DNA verdauen. Da Sie 10-20 Maßeinheiten Enzym hinzufügen, konnten Sie 10ug von DNA in 1 Stunde sogar verdauen! Enzyme sind vergeuden sie nicht unnötig kostspielig!

Anmerkungen über Enzym-Verbrauch:

• Halten Sie Enzyme kalt.
• Halten Sie immer Beschränkung Enzyme auf Eis !
• Setzen Sie die Zeit herab, die Sie Beschränkung Enzyme auf Eis haben. Sie können dies leicht tun, indem Sie eine Kühlbox kaufen (die im Allgemeinen ein Block des Metalls ist, das, Sie Ihre Enzyme innen halten)

Referenzen:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. und T. Maniatis.(1989) molekulares Klonen, ein Laborhandbuch. Zweite Ausgabe. Kalte Frühling Hafen-Laborpresse. pp. 5.3- 5.32.

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