Histon-Acetylierung

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Histon-Acetylierung

Vincent 1964 entdeckte Allfrey, dass Histone in acetylierten und unacetylated Formen gefunden werden können. Die acetylierten Formulare haben die Acetylgruppen, die den Aminogruppen auf Lysinseitenketten hinzugefügt werden. Allfrey entdeckte auch, dass Acetylierung mit Genaktivität aufeinander bezieht. Die Unacetylated Histone, hinzugefügt DNA, neigen, Übertragung zu unterdrücken, während acetylierte Histone schwächere Hemmer der Übertragung sind. Diese Resultate deuten folglich an, dass es Enzyme in den Kernen gibt, die und deacetylate Histone acetylieren, und folglich Genaktivität beeinflußt.

James Brownell und David Allis in 1996 folgten, mit, eine Histonacetyltransferase (HUT) zu identifizierenen und zu reinigen. HUT ist ein Enzym, das Acetylgruppen von einem Spender (Acetyl-CoA) auf Kernhistone überträgt. Zwecks dieses Enzym Brownell und Allis zu lokalisieren begann mit Tetrahymena (ciliated Protozoan) Zellen weil dieser Organismus Histone hat die schwer acetyliert werden, das andeutet dass diese Zellen verhältnismäßig hohe Konzentrationen des HUTES enthalten. Sie bereiteten Auszüge vom macronuclei (die großen Tetrahymena Kerne, die die aktiven Gene enthalten) vor und unterwarfen sie Gelelektrophorese in einem SDS-Gel, das mit Histonen imprägniert wurde. HUT-Aktivität wurde entdeckt, indem man das Gel in einer Lösung des Acetyls-CoA mit einem radioaktiven Kennsatz in der Acetylgruppe tränkte. Wenn das Gel ein Band mit HUT-Aktivität enthielt, würde der HUT beschriftete Acetylgruppen vom Acetyl-CoA auf die Histone übertragen. Dieses würde ein beschriftetes Band der acetylierten Histone im Gel in der Position des HATactivity herstellen. Um die beschrifteten Histone zu entdecken, wuschen sie weg das ohne Reaktion Acetyl-CoA, dann unterwarfen das Gel flurography.

Dieses Anfangskennzeichen der HUT-Aktivität wurde weiter von Allis und von den Kollegen, die eine molekulare Klonentechnik verwenden, um mehr über p55 und sein Gen zu erlernen gefolgt. Zuerst reinigten sie die HUT-Aktivität weiter, unter Verwendung der biochemischen Standardtechniken. Sobald sie die HUT-Aktivität im Wesentlichen zur Homogenität reinigten, lokalisierten sie genug von ihr, um eine teilweise Aminosäurereihenfolge zu erhalten. Unter Verwendung dieser Reihenfolge konzipierten sie ein Set degenerierte Oligonucleotides, die für Teile der Aminosäurereihenfolge codierten und folglich zur macronuclear genomic DNA hybridisierten (oder zur zellularen RNS). Unter Verwendung dieser Oligonucleotides, da Zündkapseln, sie PCR durchführten, dann klonte die PCR-Produkte. Sie erhielten die niedrigen Reihenfolgen von einigen der geklonten PCR-Produkte und überprüften sie, um zu überprüfen dass die internen Teile, die auch für bekannte HUT-Aminosäurereihenfolgen codiert wurden. Keine der PCR-Klone enthielten komplette cDNAs, so diese Arbeitskräfte ausdehnten sie in 5 ' und 3 ' Richtungen, unter Verwendung der RENNEN-Prozedur oder in der schnellen Verstärkung der cDNA Enden. (Sprechen Sie RENNEN-Diagramm für weitere Erklärung an).

Allis und Kollegen verwendeten eine geänderte Version von ' Prozedur des RENNENS diesen 5, in der sie das cDNA cyclized, also konnten sie interne Zündkapseln für Vorwärts- und Rück-PCR-Schiess-Zündsatz benutzen. Dieser Trick ließ sie die, 3 anzubinden vermeiden ' Ende des ersten Strang cDNA mit Terminaltransferase. Schließlich erhielten sie einen cDNA Klon, der das volle 421 Protein der Aminosäure p55 kodierte.

Die Aminosäurereihenfolge, die von der niedrigen Reihenfolge des cDNA p55 geschlossen wurde, war der Aminosäurereihenfolge eines Hefeproteins sehr ähnlich, das Gcn5p genannt wurde. Gcn5p ist als Vermittler der säurehaltigen Übertragungaktivatoren wie Gcn4p identifizierent worden, also schlug die Aminosäurereihenfolgenähnlichkeit vor, dass die p55 und Gcn5p Hüte sind, die in Genaktivierung miteinbezogen werden. Um zu überprüfen dass Gcn5p HUT-Aktivität hat, drückten Allis und Kollegen sein Gen in Escherichia Coli aus, dann unterwarfen es und p55 der SDS-PAGE Aktivitäts-Gelprobe. Beide Proteine freie HUT-Aktivität gezeigt. So mindestens hat ein HUT (Gcn5p) HUT und Übertragung Coaktivator Aktivitäten. Er scheint, eine direkte Rolle in der Genaktivierung zu spielen, indem er Histone acetyliert.

p55 und Gcn5p sind der Typ Hüte (HUT wie) das im Kern existieren und werden anscheinend in Genregelung miteinbezogen. Sie acetylieren Kernhistone auf ihren lysinreichen N-Terminal Endstücken. Diese sind dustunct vom Typen b-Hüte (HUT BS) die im Zytoplasma gefunden und eben synthetisierte Histone H3 und H4 acetylieren werden, also können sie in nucleosomes richtig zusammengebaut werden. Die Acetylgruppen, die von HAT BS hinzugefügt werden, werden später in den Kern durch Histon deacetylases gelöscht. Aller bekannte HUT wie, einschließlich p55 und Gcn5p, enthalten ein bromodomain, während aller bekannte HUT BS ein bromodomain ermangeln. Da kann HUT wie im Acetylieren der Histone im Chromatin, aber in HUT BS sind nicht miteinbezogen werden, das bromodomain dem HUT als Bindung zum Chromatin helfen.

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