Genomic DNA-Lokalisierungs-Protokoll

Auswählen einer Genomic DNA-Reinigung-Methode

Das Ziel der genomic DNA-Lokalisierung hängt von ab, was die Anwendungen der DNA nach Lokalisierung. Reinheit, Quelle, Quantität und Qualität von DNA sind alle Punkte, die vor genomic DNA-Extraktion angesprochen werden müssen. Ein vollständiger Hauptrechner der verschiedenen Methoden, Technologien und Installationssätze sind vorhanden jetzt für Forscher, genomic DNA von den Zellen zu lokalisieren.

Quantität DNA benötigt
Molekulargewicht und Größe von DNA
Reinheit von DNA benötigt
Stromabwärts gerichtete Anwendungen von DNA
Zeit vorhanden
Mühelosigkeit der DNA-Extraktiontechnik oder -methode
Unkosten oder Geld vorhanden

Selbst erzeugte oder Laborspezifische DNA-Extraktionmethoden häufig ziemlich gut für Labors, die sie entwickelt haben und verwenden regelmäßig diese Protokolle.

Beachten Sie jedoch Mangelnormierung dieser Methoden. Auch der DNA-Ertrag und DIE DNA-Qualität sind nicht immer von einer Person zum folgenden reproduzierbar.

Hintergrund auf Genomic DNA-Lokalisierung und Reinigung

Im Allgemeinen beziehen alle Methoden die Unterbrechung und die Zerstörung der Zellen mit ein. Dieses wird manchmal vom Abbau von RNS gefolgt (durch RNAses, Salz oder andere Methoden). Einschließlich wählen, welche Methode zu verwenden von vielen Auswahlfaktoren abhängt:

DNA wird von den Proteinen durch einige Methoden einschließlich Verdauung der Proteine durch die Enzymproteinase K. Proteine werden gelöscht nach durch Aussalzen, organische Extraktion oder das Binden der DNA einem festphasigen Support lokalisiert (wie einer Anionenaustauschspalte- oder -silikontechnologie).

DNA wird schließlich durch Äthanolniederschlag oder Isopropanolniederschlag wieder hergestellt.

Im Allgemeinen können die Trennung von DNA von den Zellen und die zellularen Bestandteile in vier Stadien unterteilt werden:

Zellenunterbrechung
Zerstörung der Zelle
Abbau der Proteine und der Verschmutzer
Wiederanlauf von DNA

In einigen genomic DNA-Lokalisierungsprotokollen werden Stadien 1 und 2 kombiniert.

Materialien benötigt für Genomic DNA-Extraktion-Methode

Zerstörung-Buffer für Genomic DNA-Rezept:

50 Millimeter Tris-HCl, pH 8.0
50mM EDTA
1% SDS
10mM NaCl

Genomic DNA-Reinigung-Methode von den Gewebe-Proben

Wählen Sie Gewebeprobe aus, um zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Probe richtig auf Eis vorbereitet und gehalten wird. Wenn die Probe nicht sofort für DNA-Extraktion benutzt wird, dann müssen die Proben entweder in der -20°C Gefriermaschine für längerfristiges oder in 4°C für kurzfristigen Verbrauch (weniger Stunden) richtig gespeichert werden.
Schneiden Sie Gewebe in kleinere Stücke. Für Leber oder anderes weiches Gewebe sorgen Sie nicht sich um die Herstellung der feinen Stücke.
Fügen Sie Gewebe einem vorgekühlten (Trockeneis) Mörtel hinzu, fügen Sie sofort flüssiger Stickstoff N2 hinzu.
Fangen Sie an, Gewebe in feines Puder zu reiben. Fügen Sie mehr Liq hinzu. N2, wie gebraucht. Übertragen Sie kaltes Puder auf das 30 ml-Gefäß, der die Mütze abgenommene Urlaub, also kann N2 verdunsten.
Fügen Sie 9 ml von pro-gewärmt hinzu (5°C) setzen Zerstörungbuffer und leicht Puder erneut aus.
Fügen Sie UL 100 von 10mg/ml von Proteinase K hinzu, (d.h., 100 ug in gelöster Form). Brüten Sie 55°C 1-18 Stunden aus. Mischen Sie leicht regelmäßig. Fügen Sie UL 100 von Proteinase K nach ersten 2 Stunden, Optimum hinzu: 3 Stunden, die Proteinase K bei 1.5 Stunden hinzufügen.
Festlichkeitprobe sehr leicht. Fügen Sie 1 ml 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml von warmem hinzu (55°C) mischen Phenol, leicht aber gänzlich für 5-10 Minuten.
Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten.
Wiederholen Sie warme Phenolextraktion.
Auszug mit gleichem Phenol des Datenträgers (10ml): CIA (Phenol mit 1 Teilen: 1 Teil CIA: CIA= 23 Teile Chloroform: 1 Teil Isoamyl- Spiritus)
Auszug mit gleicher Extraktion des Datenträgers (10ml) CIA
Obere Phase sollte verhältnismäßig klar sein, wenn sie große weiße Schläge enthält, oder ist sehr milchig, brüten (i) an 68°C 15 Min. und am Re-phenol Auszug, (ii) Anfang wieder aus, aber brüten länger mit PK aus.
Übergangsobere Phase zum neuen Gefäß. Fügen Sie 2 Datenträger des kalten Äthanols hinzu und mischen Sie leicht (Salz: Na0Ac ist bereits in gelöster Form). Unter Verwendung eines Hakens und eines Siegelpasteur pipettieren Sie Spule heraus DNA. Wischen Sie überschüssiges Äthanol auf der Seite der Gefäße ab. Setzen Sie in 2-5 mls TE erneut aus. Stellen Sie sicher, dass DNA vollständig aufgelöst wird (Urlaub auf leichtem Schüttel-Apparat.)
Fügen Sie RNasemischung hinzu (100 ug RNase A, 10U von RNaseT1). Brüten Sie 30 minimale 37°C. aus ** Sie konnten die RNase vor der Proteinase K hinzufügen, brüten an 37°C 1 Stunde lang aus und beginnen dann Proteinaseverdauung. Sie konnten Jobstepp 15- dann überspringen.
Fügen Sie 100 ug Proteinase K, incubae 37°C 30 Minuten hinzu.
Fügen Sie 1/10 Vol. 3M Na0Ac, Phenolauszug einmal, Phenol hinzu: CIA-Auszug zweimal, CIA-Auszug einmal.
Fügen Sie 2.5 Datenträger von EtOH hinzu, setzen Sie in -20°C eine 30 Min.-Zentrifuge 20 Min. ein.
Waschen Sie sich gut mit 70%, löschen Sie alles EtOH. Wenn Sie trocknen, tun Sie nicht über TROCKENEM.
Setzen Sie sorgfältig, langsam in1-2mls TE erneut aus (Tris-EDTA Buffer). (1x oder 0.1x).