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Genomic DNA Lokalisierung Protokoll

Auswählen einer Genomic DNA Reinigung-Methode

Das Ziel der genomic DNA Lokalisierung hängt von ab, was die Anwendungen der DNA nach Lokalisierung. Reinheit, Quelle, Quantität und Qualität von DNA sind alle Punkte, die vor genomic DNA Extraktion angesprochen werden müssen. Ein vollständiger Hauptrechner der unterschiedlichen Methoden, Technologien und Installationssätze sind vorhanden jetzt für Forscher, genomic DNA von den Zellen zu lokalisieren.

• Quantität DNA benötigt
• Molekulargewicht und Größe von DNA
• Reinheit von DNA benötigt
• Abwärts gerichtete Anwendungen von DNA
• Zeit vorhanden
• Mühelosigkeit der DNA Extraktiontechnik oder -methode
• Unkosten oder Geld vorhanden

Hausgewachsene oder Laborspezifische DNA Extraktionmethoden häufig ziemlich gut für Labors, die sie entwickelt haben und verwenden regelmäßig diese Protokolle.

Beachten Sie jedoch diese Methoden Mangelnormierung. Auch das DNA Ergebnis und DIE DNA Qualität sind nicht immer von einer Person zum folgenden reproduzierbar.

Hintergrund auf Genomic DNA Lokalisierung und Reinigung

Im Allgemeinen beziehen alle Methoden die Unterbrechung und den Lysis der Zellen mit ein. Dieses wird manchmal vom Abbau von RNS gefolgt (durch RNAses, Salz oder andere Methoden). Einschließlich wählen, welche Methode zu verwenden von vielen Auswahlfaktoren abhängt:

DNA wird von den Proteinen durch einige Methoden einschließlich Verdauung der Proteine durch die Enzymproteinase K. Proteins werden gelöscht nachher durch Aussalzen, organische Extraktion oder das Binden der DNA einem festphasigen Support lokalisiert (wie einer Anionenaustauschspalte- oder -silikontechnologie).

DNA wird schließlich durch Äthanolniederschlag oder Isopropanolniederschlag wieder hergestellt.

Im allgemeinen können die Trennung von DNA von den Zellen und die zellularen Bestandteile in vier Stadien geteilt werden:

1. Zelle Unterbrechung
2. Lysis der Zelle
3. Abbau der Proteine und der Verschmutzer
4. Wiederanlauf von DNA

In einigen genomic DNA Lokalisierung Protokollen werden Stadien 1 und 2 kombiniert.

Materialien benötigten für Genomic DNA Extraktion-Methode

Lysis-Buffer für Genomic DNA Rezept:

50 Millimeter Tris-HCl, pH 8.0
50mM EDTA
1% SDS
10mM NaCl

Genomic DNA Reinigung-Methode von den Gewebe-Proben

1. Wählen Sie Gewebeprobe aus, um zu verwenden. Stellen Sie sicher, daß die Probe richtig auf Eis vorbereitet und gehalten wird. Wenn die Probe nicht sofort für DNA Extraktion benutzt wird, dann müssen die Proben entweder in der -20°C Gefriermaschine für längerfristiges oder in 4°C für kurzen Bezeichnung (wenige Stunden) Verbrauch richtig gespeichert werden.
2. Schneiden Sie Gewebe in kleinere Stücke. Für Leber oder anderes weiches Gewebe sorgen Sie nicht sich um das Bilden der feinen Stücke.
3. Fügen Sie Gewebe einem vorgekühlten (Trockeneis) Mörtel hinzu, fügen Sie sofort flüssiger Stickstoff N2 hinzu.
4. Fangen Sie an, Gewebe in feines Puder zu reiben. Fügen Sie mehr Liq. N2 hinzu, wie gebraucht. Übertragen Sie kaltes Puder auf das 30 ml Gefäß, der die Mütze abgenommene Urlaub, also kann N2 verdunsten.
5. Fügen Sie 9 ml des pro-gewärmten Buffers des Lysis (5°C) hinzu und setzen Sie leicht Puder erneut aus.
6. Fügen Sie UL 100 von 10mg/ml von Proteinase K hinzu, (d.h., 100 ug in der Lösung). Brüten Sie 55°C 1-18 Stunden aus. Mischen Sie leicht regelmäßig. Fügen Sie UL 100 von Proteinase K nach ersten 2 Stunden, Bestwert hinzu: 3 Stunden, die Proteinase K bei 1.5 Stunden hinzufügen.
7. Festlichkeitprobe sehr leicht. Fügen Sie 1 ml 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml des warmen Phenols (55°C) hinzu, mischen Sie leicht aber throughly für 5-10 Minuten.
8. Zentrifugieren Sie Proben für 15 Minuten.
9. Wiederholen Sie warme Phenolextraktion.
10. Extrakt mit gleichem Phenol des Datenträgers (10ml): CIA (Teil CIA 1 Teils phenol:1: CIA = 23 Teile Isoamyl- Spiritus des chloroform:1 Teils)
11. Extrakt mit gleicher Extraktion des Datenträgers (10ml) CIA
12. Obere Phase sollte verhältnismäßig klar sein, wenn sie große weiße Schläge enthält, oder ist sehr milchig, brüten (i) an 68°C 15 Min. und am Re-Phenol Extrakt, (ii) Anfang wieder aus, aber brüten länger mit P-K aus.
13. Übergangsobere Phase zum neuen Gefäß. Fügen Sie 2 Datenträger des kalten Äthanols hinzu und mischen Sie leicht (Salz: Na0Ac ist bereits in gelöster Form). Mit einem Haken und einem Siegelpasteur pipettieren Sie Spule aus DNA. Wischen Sie überschüssiges Äthanol auf der Seite der Gefäße ab. Setzen Sie in 2-5 mls TE erneut aus. Stellen Sie sicher, daß DNA vollständig aufgelöst wird (Urlaub auf leichtem Schüttel-Apparat.)
14. Fügen Sie RNasemischung hinzu (100 ug RNase A, 10U von RNaseT1). Brüten Sie 30 minimale 37°C aus. ** konnten Sie die RNase vor der Proteinase K hinzufügen, brüten an 37°C 1 Stunde lang aus und beginnen dann Proteinaseverdauung. Sie konnten Jobstep 15 dann überspringen -.
15. Fügen Sie 100 ug Proteinase K, incubae 37°C 30 Minuten hinzu.
16. Fügen Sie 1/10 Vol. 3M Na0Ac, Phenolextrakt einmal, Phenol:CIA Extrakt zweimal, CIA Extrakt einmal hinzu.
17. Fügen Sie 2.5 Datenträger von EtOH hinzu, setzen Sie sich in -20°C 30 Minuten. Zentrifugieren Sie 20 Minuten.
18. Waschen Sie gut mit 70%, löschen Sie alles EtOH. Wenn Sie trocknen, nicht der TROCKENE Überschuß.
19. Setzen Sie sorgfältig, langsam in1-2mls TE erneut aus (Tris-EDTA Buffer). (1x oder 0.1x).

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