Prüfendna-Protein-Interaktionen

Erlernen Sie über, wie man DNA-Protein Interaktionen prüft.

PrüfenDNAProtein Interaktionen

Es gibt vier wichtige Techniken für die Prüfung von DNA-Protein Interaktionen. Die ersten zwei Techniken (Filter-Schwergängigkeit und Gel-Mobilitäts-Schicht) stellen fest, wenn Ihre DNA auf Protein einwirkt. Die anderen zwei Techniken (DNAseFootprinting und DMS Footprinting) zeigen an, wo die Zielsite der Interaktion zwischen Protein und DNA auf der DNA liegt.

Filter-Schwergängigkeit

Nitrozellulosemembranenfilter sind allgemein verwendet, Lösungen zu filtersterilisieren. Nitrozellulosefilter können DNA, aber nur unter bestimmten Bedingungen binden. Singlestranded DNA bindet betriebsbereit an Nitrozellulose, aber Doppeltes angeschwemmte DNA tut an sich nicht. Einerseits bindet Protein und wenn ein Protein zu double-stranded DNA gesprungen wird, bindet der Komplex ProteinDNA. Sprechen Sie bitte Nitrozellulose-Filter-verbindlichen Probenartikel zu mehr Information an.

Gelatieren Sie Mobilitäts-Schicht

Um DNA-Protein Interaktionen zu messen beruht diese Technik auf der einfachen Tatsache dass eine kleine DNA eine viel höhere Mobilität in der Gelelektrophorese hat als die gleiche DNA tut wenn sie zu einem Protein zu springen ist. Wir können ein Sortierung Doppeltes angeschwemmtes DNA-Fragment folglich beschriften, dann mischen es mit einem Protein, und electrophorese der Komplex. Dann unterwerfen wir das Gel in der Autoradiografie, um die beschriftete Sorte zu entdecken. Das kleine der DNA ist in dieser Probe wichtig. Wenn ein vollständiges Gen benutzt wurden, würde seine Mobilität bereits sehr niedrig sein, und die Mobilitätsschicht, die durch Proteinschwergängigkeit verursacht wurde, würde schwierig zu entdecken sein. Folglich müssen wir ungefähr wenig sonst wissen, wo das Protein an bindet die DNA, also wir ein kurzes Beschränkungsfragment vorbereiten können, oder sogar ein synthetischer double-stranded Oligonucleotide, der die Zielsite für das Protein enthält, aber.

DNAseFootprinting

Sobald wir wissen, dass ein Protein an eine gegebene DNA bindet, können wir Footprinting benutzen, um herauszufinden, wo die Zielsite auf der DNA liegt. DNAse Footprinting beruht auf der Tatsache, dass ein Protein, indem es an DNA bindet, die verbindliche Site bedeckt und also schützt sie vor Angriff durch Dnase. In diesem Sinne lässt er einen „Abdruck“ auf der DNA. Der erste Jobstepp in einem Footprintingexperiment ist Ende-beschriften die DNA. Wir können jeden Strang, aber nur einen pro Experiment beschriften. Zunächst binden wir das Protein an die DNA. Dann behandeln wir den DNA-Protein Komplex mit DNAse I unter milden Bedingungen (sehr kleine DNAse), damit ein Durchschnitt von nur geschnittenem einem pro DNA-Molekül auftritt. Zunächst löschen wir das Protein von der DNA, trennen die DNA-Stränge, und electrophorese gelatieren die resultierenden Fragmente auf einem hohen Auflösung polyacylamide neben Größenmarkierungen. Fragmente ergeben sich aus dem anderen Ende der DNA außerdem, aber wir entdecken sie nicht, weil sie unbenannt sind. Wir schließen immer eine Steuerung mit alleindna (kein Protein) ein und verwenden normalerweise mehr als eine Proteinkonzentration, also können wir durch das stufenweise Schwinden der Bänder in der Abdruckregion sehen, dass Schutz der DNA von der Konzentration des hinzugefügten Proteins abhängt. Der Abdruck stellt die Region von DNA geschützt durch das Protein dar und erklärt uns, wo folglich das Protein bindet.

DMS Footprinting

DNAse Footprinting gibt eine gute Idee des Standorts der verbindlichen Sites für das Protein, aber DNAse ist ein Makromolekül und ist folglich ein ziemlich stumpfes Instrument für das Prüfen der feinen Details der verbindlichen Sites. Welches bedeutet, kann der dort Abstände in der Interaktion zwischen Protein sein und DNA, die DNAse nicht in und folglich passen würde, nicht entdecken würde. Außerdem stören DNA-verbindliche Proteine häufig die DNA innerhalb der verbindlichen Region und verzerren die doppelte Schnecke. Diese Störungen sind interessant, aber werden nicht im Allgemeinen durch Dnase Footprinting entdeckt, weil das Protein die DNAse weg hält. Um ausführlicheren Footprinting zu tun, benötigen wir ein kleineres Molekül das in die Winkel und die Ritzen des komplizierten DNA-Proteins passen kann und decken mehr der Feinheiten der Interaktion auf. Ein Lieblingshilfsmittel für diesen Job ist das methylierenmittel dimethylsulfate (DMS).

Mit DMS Footprinting laufen wir genauso wie im DNAse Footprinting an, indem wir die DNA und die Schwergängigkeit das Protein Ende-beschriften. Dann methylieren wir den DNA-Protein Komplex mit DMS, unter Verwendung einer milden Behandlung, damit in Durchschnitt nur eine Methylierung sogar pro DNA-Molekül auftritt. Zunächst verdrängen stellen wir das Protein und behandeln die DNA mit einem Reagens, das methylierte Purine löscht und apurinic Sites (deoxyriboses ohne Unterseiten) auf der DNA her. Dann brechen wir die DNA an diesen apurinic Sites. Diese Reaktionen sind die selben wie die Maxam-Gilbert DNA, die Reaktionen sequenziell ordnet. Schließlich wir electrophorese die DNAfragmente und Autoradiograph das Gel, zum der beschrifteten DNA zu entdecken versehen mit einem Band. Jedes Band beendet nahe bei einem Nukleotid, das und folglich ungeschützt durch das Protein methyliert wurde.

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