Prüfende DNA Protein-Interaktionen

Erlernen Sie über, wie man DNA-Protein Interaktionen prüft.

Prüfende DNAProtein Interaktionen

Es gibt vier wichtige Techniken für das Prüfen von von DNA-Protein Interaktionen. Die ersten zwei Techniken (Filter-Schwergängigkeit und Gel-Mobilität Schicht) stellen fest, wenn Ihre DNA auf Protein einwirkt. Die anderen zwei Techniken (DNAse Footprinting und DMS Footprinting) zeigen an, wo die Zielsite der Interaktion zwischen Protein und DNA auf der DNA liegt.

Filter-Schwergängigkeit

Nitrozellulosemembrane Filter werden geläufig benutzt, um Lösungen zu filtersterilisieren. Nitrozellulosefilter können DNA, aber nur unter bestimmten Bedingungen binden. Singlestranded DNA bindet betriebsbereit an Nitrozellulose, aber Doppeltes angeschwemmte DNA selbst nicht. Andererseits bindet Protein und wenn ein Protein zu double-stranded DNA gesprungen wird, bindet der Komplex Protein-DNA. Sprechen Sie bitte Nitrozellulose-Filter-verbindlichen Probe Artikel zu mehr Information an.

Gelatieren Sie Mobilität Schicht

Um DNA-Protein Interaktionen zu messen beruht diese Technik auf der einfachen Tatsache daß eine kleine DNA eine viel höhere Mobilität in der Gelelektrophorese hat als die gleiche DNA wenn sie zu einem Protein springen soll. Wir können ein Sortierung Doppeltes angeschwemmtes DNA Fragment folglich beschriften, dann mischen es mit einem Protein, und electrophorese der Komplex. Dann unterwerfen wir das Gel in der Autoradiographie, um die beschriftete Sorte zu entdecken. Die kleine Größe der DNA ist in dieser Probe wichtig. Wenn ein vollständiges Gen benutzt wurden, würde seine Mobilität bereits sehr niedrig sein, und die Mobilität Schicht, die durch Proteinschwergängigkeit verursacht wurde, würde schwierig zu entdecken sein. Folglich müssen wir ungefähr wenig sonst wissen, wo das Protein an bindet die DNA, also wir ein kurzes Beschränkung Fragment vorbereiten können, oder sogar ein synthetischer double-stranded Oligonucleotide, der die Zielsite für das Protein enthält, aber.

DNAse Footprinting

Sobald wir wissen, daß ein Protein an eine gegebene DNA bindet, können wir das Footprinting verwenden, zum herauszufinden, wo die Zielsite auf der DNA liegt. Die DNAse, die footprinting ist, beruht auf der Tatsache, daß ein Protein, indem es an DNA bindet, die verbindliche Site bedeckt und also schützt sie vor Angriff durch Dnase. In dieser Richtung läßt sie einen "Abdruck" auf der DNA. Der erste Jobstep in einem footprinting Experiment ist Ende-beschriften die DNA. Wir können jede Faser, aber nur eine pro Experiment beschriften. Zunächst binden wir das Protein an die DNA. Dann behandeln wir den DNA-Protein Komplex mit DNAse I unter milden Bedingungen (sehr kleine DNAse), damit ein Durchschnitt von nur geschnittenem einem pro DNA Molekül auftritt. Zunächst löschen wir das Protein von der DNA, trennen die DNA Fasern, und electrophorese gelatieren die resultierenden Fragmente auf einem Höhe Zerlegung polyacylamide neben Größe Markierungen. Fragmente entstehen aus dem anderen Ende der DNA außerdem, aber wir entdecken sie nicht, weil sie unbenannt sind. Wir schließen immer eine Steuerung mit alleincDna (kein Protein) ein und verwenden normalerweise mehr als eine Proteinkonzentration, also können wir durch das stufenweise Verschwinden der Bänder in der Abdruckregion sehen, daß Schutz der DNA von der Konzentration des hinzugefügten Proteins abhängt. Der Abdruck stellt die Region von DNA geschützt durch das Protein dar und erklärt uns, wo folglich das Protein bindet.

DMS Footprinting

Die footprinting DNAse gibt eine gute Idee des Standorts der verbindlichen Sites für das Protein, aber DNAse ist ein Makromolekül und ist folglich ein ziemlich stumpfes Instrument für das Prüfen der feinen Details der verbindlichen Sites. Welches bedeutet, kann der dort Abstände in der Interaktion zwischen Protein sein und DNA, die DNAse nicht in und folglich passen würde, nicht entdecken würde. Außerdem DNA stören verbindliche Proteine häufig die DNA innerhalb der verbindlichen Region und verzerren die doppelte Schnecke. Diese Störungen sind interessant, aber werden nicht im Allgemeinen von Dnase entdeckt, die footprinting ist, weil das Protein die DNAse weg hält. Um das ausführlichere Footprinting zu tun, benötigen wir ein kleineres Molekül das in die Nooks und die Ritzen des komplizierten DNA-Proteins passen kann und decken mehr der Feinheiten der Interaktion auf. Ein Lieblingshilfsmittel für diesen Job ist das methylierende Mittel dimethylsulfate (DMS).

Wenn das DMS footprinting, laufen wir genauso wie in der DNAse an, die footprinting ist, indem wir die DNA und die Schwergängigkeit das Protein Ende-beschriften. Dann methylieren wir den DNA-Protein Komplex mit DMS mit einer milden Behandlung so, daß auf Durchschnitt nur eine Methylierung sogar pro DNA Molekül auftritt. Zunächst verdrängen stellen wir das Protein und behandeln die DNA mit einem Reagens, das methylierte Purine löscht und apurinic Sites (deoxyriboses ohne Unterseiten) auf der DNA her. Dann brechen wir die DNA an diesen apurinic Sites. Diese Reaktionen sind dieselben wie die Maxam-Gilbert DNA, die Reaktionen sequentiell ordnet. Schließlich wir electrophorese die DNA Fragmente und autoradiograph das Gel, zum der beschrifteten DNA zu entdecken versehen mit einem Band. Jedes Band beendet nahe bei einem Nukleotid, das und folglich ungeschützt durch das Protein methyliert wurde.

Sehen Sie das DNA Molekül in 3-Dimensions

Desoxyribonukleinsäure