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DNA Niederschlag mit Salz und Äthanol ist ein geläufig verwendetes Protokoll im Labor für das Konzentrieren der Nukleinsäuren wie DNA und RNS. Die grundlegende Methode ist Salz und Äthanol werden der wässerigen Lösung hinzugefügt, die die Nukleinsäure erzwingt, aus Lösung heraus auszufällen. Ccentrifugation der ausgefällten Nukleinsäuren und des Waschens lokalisiert die Nukleinsäure vom Rest der Lösung. Die Nukleinsäure, die Tablette enthält, wird dann mit Äthanol der Kälte 70% gewaschen, um das Salz zu löschen.
Dann wird ein zweiter Zentrifugierungjobstep verwendet, um die Nukleinsäure weg vom Äthanol zu lokalisieren erlaubend, daß das Äthanol gelöscht wird. Die Nukleinsäuretablette wird dann trocknen lassen und wird dann im frischen wäßrigen T (Tris) Buffer oder im Wasser erneut ausgesetzt.
Ein Muß versteht zuerst, warum Nukleinsäuren im Wasser löslich sind.
Wasser (H2O) ist ein polares Molekül, das eine teilweise negative Ladung nahe passenden des Sauerstoffatoms hat, unshared Paare Elektronen und teilweise positive Ladungen nahe den Wasserstoffatomen.
Wegen dieser polaren Natur des Wassers, anderer polarer Moleküle wie DNA oder der RNS kann auf die Wassermoleküle elektrostatisch einwirken und sie im Wasser leicht sich auflösen lassen.
Niederschlag bricht diese Interaktion und erstellt Neue und erlaubt, daß die DNA oder die RNS, aus Lösung herauszukommen und leicht lokalisiert wird.
Rolle des Salzes im Protokoll ist, die Ladungen auf dem Zuckerphosphatrückgrat der Nukleinsäure zu neutralisieren ob DNA oder RNS. Geläufig benutzte Salze DNA und RNS-IM Niederschlag enthalten Natriumazetat.
In der aqeous Lösung zerbricht bildet Natriumazetat in Na+ und [ CH3COO ] -. die positiv belasteten Natriumionen neutralisieren negativ belastetes Rückgrat auf der DNA, spezifisch die PO3- Gruppen auf den Nukleinsäuren und das Nukleinsäuremolekül weites weniger hydrophiles, und folglich viel weniger löslich im Wasser.
Elektrostatische Anziehungen zwischen den Na+ Ionen in gelöster Form und den PO3- Ionen werden durch Coulomb s’Gesetz vorgeschrieben, das durch die Dielektrizitätskonstante der Lösung beeinflußt wird. Wasser hat eine hohe Dielektrizitätskonstante, die es ziemlich schwierig läßt, damit das Na+ und das PO3- zusammen kommt. Äthanol hat andererseits eine viel niedrigere Dielektrizitätskonstante und bildet es viel einfacher, damit Na+ auf das PO3 - einwirkt, es s’Ladung abschirmt und die Nukleinsäure weniger hydrophil bildet und sie zum Tropfen aus Lösung heraus verursacht.
Ausbrütung der Nukleinacid/salt/ethanol Mischung bei den niedrigen Temperaturen (z.B. -20 oder -80C) wird geläufig in den Protokollen wie benötigt in den Protokollen zitiert. Nukleinsäuren jedoch Konzentrationen an an der so niedrigen, wie 20ng/mL an an 0-4C also ausfällt, Ausbrütung für 15-30 Minuten auf Eis ist genügend.
Das Ziel dieses Protokolls ist, DNA auszufällen, da das Namens sagt. Dieses wird normalerweise mit Phenolchloroformextraktion verbunden und wird als Methode des Reinigens der Nukleinsäuren verwendet. In dieses kann auch verwendet werden als Methode für das Ändern, welcher Lösung oder Ihre Nukleinsäure ist puffern Sie.
Dieses Protokoll arbeitet auch für RNS-Niederschlag (Nehmenobacht zu uns freie Materialien der RNase in diesem Fall).
-20°C eine Stunde lang ist fein für das Verwenden der größeren (1mL der bakteriellen Kultur, des Plasmids) Mengen DNA
Die DNA Tablette nicht immer ist sichtbar abhängig von, wieviel DNA Sie ausfällen. So immer Nehmenobacht, wenn Ihre Proben in der Zentrifuge geladen werden, um sich an die Richtung zu erinnern, die sie gegenüberstellen. Die DNA Tablette ist von seiten des Gefäßes, welches die Außenseite der Zentrifuge gegenüberstellt.
Dieses Protokoll fällt alle Nukleinsäuren, nicht gerechte DNA aus. Wenn Sie nicht RNS in Ihrer Probe wünschen, soll eine der vielen Methoden, sie zu beschäftigen in TE + RNase am letzten Jobstep einfach erneut aussetzen und ihn bei der Raumtemperatur für 15mins-1hr lassen.
Wenn Salz ausfällt, kann es durch das Waschen mit 70%
EtOH leicht gelöscht werden. Die DNA löst nicht sich bei der
Raumtemperatur auf,
aber das Salz wird. (dieses kann auch verwendet
werden, um CsCl zu löschen. Ich finde einige Wäschen mit 70%
EtOH bin einfacher als Dialyse, wenn ich CsCl von einer
Plasmidvorbereitung löschen muß. ANMERKUNG: kühlen Sie
NICHT, wenn CsCl gelöscht wird, das einen Hochtemperaturkoeffizienten
der Lösung. hat)
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