DNAFootprinting

Molekulare Station des copyright-2007

Hintergrund auf DNAFootprinting

DNAse Footprinting ist eine Molekularbiologiemethode, die die Abfragung der DNA-Protein Interaktionen aktiviert, indem es das Eigentum ausnutzt, dass ein Protein, das auf DNA einwirkt, die DNA an dieser Interaktionssite vor Beschränkungsverdauung oder enzymatischer Spaltung der DNAase schützt. Ein DNA-Beschränkungsfragment, das die spezifische verbindliche Site enthält, wird bei einem Ende, normalerweise mit 32P beschriftet und benutzt für Footprinting.

Protein und DNA werden zusammen hybridisieren und binden lassen.

DNAfootprinting verwendet die Enzym DNAse I oder Desoxyribonukleinsäurenuklease I, um radioaktive (oder beschriftet) DNA weg zu verdauen oder frei zu schneiden, welche die proteingebundene DNA geschützt verlässt. Die DNA-Beschränkungsfragmente werden leichtfertig mit DNAse I behandelt, die single-strand Brüche (Einschnitte) in der DNA bildet. Einer kleinen Menge des Enzyms wird so verwendet, dass es einen Durchschnitt von weniger als 1 Einschnitt/von Strang gibt. Die Reaktion wird dann gestoppt, wird die DNA denaturiert, und die Mischung wird auf ein denaturierenpolyacrylamid laufen gelassen, das Gel sequenziell ordnet. Diese Fragmente, die durch Gelelektrophorese getrennt werden, werden herausgestellt, um den geschützten DNA-Bereich zu entdecken, indem man das Streifenbildungsspaltungmuster auf dem Gel analysiert.

Das Spaltungmuster der DNA in Ermangelung eines DNA-verbindlichen Proteins, gewöhnlich gekennzeichnet als freie DNA, wird mit dem Spaltungmuster von DNA in Anwesenheit eines DNA-verbindlichen Proteins verglichen. Wenn das Protein DNA bindet, wird die verbindliche Site vor enzymatischer Spaltung geschützt. Dieser Schutz ergibt einen freien Bereich auf dem Gel, das als der „Abdruck“ gekennzeichnet.

Indem man die Konzentration des DNA-bindenen Proteins sich unterscheidet, kann die verbindliche Affinität des Proteins entsprechend der minimalen Konzentration des Proteins geschätzt werden, an der ein Abdruck beobachtet wird.

DNAsefootprinting-Buffer-Rezepte

DNAsefootprinting-verbindliches Buffer-Rezept

2X ohne KCl/für 10mls:

Menge: [Schluss]
Tris-HCl pH7.6: UL 500 von 1M: 50 Millimeter
MgCl2: 125ul von 1M: 12.5mM
EDTA: UL 2 von 0.5M: 1mM
Glyzerin: 2 mls: 20%
DTT: UL 10 von 1M: 1 Millimeter

Verbindlicher Buffer (Gel-Schichtbuffer)

5X ohne KCL
[Schluss]: Bestandteil
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml: Poly (Digleichstrom) Poly (Digleichstrom)

Ca/Mg Buffer

Für 10mls
CaCl2: UL 50 von 1M: 5 Millimeter
MgCl2: UL 100 von 1M: 10 Millimeter

Laden-Lösung
0.1 M: NaOH: formamid (1: 2 v/v)
0.1%: Xylen cyanol
0.1%: Bromophenolblau

Stoppen Sie Buffer
10mls
NaCl: UL 400 von 5M: 200 Millimeter
EDTA: UL 600 von 0.5M: 30 Millimeter
SDS: 1 ml-10%:1%

TEBe (Tris-EDTA-Betamercap.)
Tris-HCl, pH-7.6:500-UL von 1 M: 50 Millimeter
EDTA: 2ul von 0.5 M: 1 Millimeter
Beta-Merkaptoäthanol: UL 10: 15mM

Buffer 10 x-K
für 1 ml
7.5:100-UL Tris-HCl-pH von 1 M: 100 Millimeter
MgCl2: UL 100 von 1 M: 100mM
DTT: UL 50 von 1M: 50 Millimeter
dH2O: UL 750

DNAsefootprinting-Protokoll

Die DNA, die enthält benutzt wird normalerweise, die verbindliche Site Ihres Proteins des Interesses. Die DNA wird, dann verdaut mit Beschränkungsfragmenten gereinigt, um von einer appopriate Größe zu sein. Das DNA-Fragment wird an einem Ende beschriftet (verbindliche Site > 25 BP vom Ende).

Eine Strangkennzeichnung kann vorbei accomplised:

Isolierung das Fragment mit den Beschränkungsenzymen, die ' Überhang 5, beschriftend mit Klenow und dem passenden heißen Nukleotid enthalten. Dann Auswahl mit einem Enzym, das ein Ende löscht.
die Isolierung eines Fragments, das mit einem Beschränkungsenzym verdaut wird, das 5 ' erstellt und Überhang die 3 ' beenden Sie, beschriftend mit Klenow nur beschriftet 5 '.
Wie in „a“ aber mit irgendeinem Enzym und der Anwendung der Polynucleotidekinase, um Ende 3 (Kinase) zu beschriften ' und dem Verdauen weg von einem der Enden mit einem zweiten (dritten) Beschränkungsenzym.
(ANZEIGE: bei der Kennzeichnung mit Klenow, am Ende der Reaktion fügen Sie einen Überfluss des kalten Nukleotids des gleichen Nukleotids hinzu, das (d.h., wenn Sie dCTP32 verwenden, fügen Sie dCTP am Ende) hinzu beschriftet wird um alle Enden sicherzustellen werden ausgefüllt gleichmäßig.

Für Klenow Fragmente holen 0.3ug UL bis 100 in TE, Hitzeabbruch Klenow bei °C 68 für 10 Minuten.

KENNZEICHNUNG mit ' Überhang einen 5

Probe RXN: 15 ng ist Notwendigkeit an jeder Reaktion. Wenn Sie Prüfspitze für viele Reaktionen bilden, erhöhen Sie EINFACH Menge DNA bis zu 300 ngs.
15ng: DNA-Fragment
UL 2: 10x K Buffer
UL 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
UL 2: 2mM @ DA, Gd dTTP
1 UL: Klenow
20 UL-abschließender Datenträger, 37°C 30 Min.
--fügen Sie 1 UL 10mM dNTP, 5 Minute @ 37°C. hinzu.

--fügen Sie 80 UL TE hinzu. 68°C 15 Minuten, setzte an Eis.
--Spalte der Drehbeschleunigung-G-50 (Drehbeschleunigung an ungefähr 2000g)
--FÜGEN Sie 1/10 Vol. 3M Na0Ac, 2.5 Datenträger EtOH hinzu, gefrieren Sie 30 Minuten, (wahlweise freigestellt, wenn [DNA] = oder > 3 ng/ul ist, konnten Sie G-50 direkt bekannt geben), Microfuge 30 Minuten.
--waschen Sie sich mit 70%
--Trocken holen Sie oben in 5ul

Verbindliche Reaktion für DNAseFootprinting

Verbindliche Reaktion sollte zwischen 10 und 150mM dem KCl haben (mehr Salz verringert zu binden aber Zunahmebesonderheit). Die typische Konzentration ist 50mM.

Protein DNA-Schwergängigkeit:
UL 25 des verbindlichen Buffers 2X ohne KCl
5ul von 3 ng/ul unilabeled DNA
UL X des KCl, zum von 10-150 Millimeter KCl zu entsprechen
dH20, zum von UL 50 minus des Datenträgers für das Binden zu entsprechen protien
1-3 Footprinting-Maßeinheiten des DNA-verbindlichen Proteins (oder 10 bis 160 ug des groben Kernauszuges)

--Mischung leicht, gefrieren 10 Minuten.

UNTERHALT-ZEITBEGRENZUNG IM VERSTAND,
--FÜGEN Sie UL 50 Lösung der Funktelegrafie-Ca/Mg, 18°C für 1 Minute hinzu.
--FÜGEN Sie UL 3 hinzu, das verdünnte DNAse RQ1 (0.05 u/ul verdünnt in Tris) 1 Minute AUSBRÜTEN.
--STOPPEN Sie Zusatz von 90 mit Lösungen des END 37°C,

--Sie sollten Phenol: CIA-und CIA-Auszug und Äthanolniederschlag.
--SETZEN Sie in 4ul der Laden-Lösung erneut aus.
--Laufen Sie auf 5% Standard-Harnstoff-DNA, die Gel sequenziell ordnet (betrachten Sie Keilgel), mit appopriate Ladenwegen wie DNA-Strichleiter, ungeschnittener DNA und Kontrollen.

Analysieren Sie Footprintingmuster.