DNA Klonen

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DNA Klonen

Eine DNA (kurz für complemantary DNA oder Exemplar DNA) ist ein DNA Exemplar einer RNS, normalerweise ein mRNA. Manchmal möchten wir eine DNA Bibliothek bilden, ein Set von klonen das Reprensenting bis zu wie möglich von den mRNAs in einem gegebenen Zelle Typen zu gegebener Zeit. Solche Bibliotheken können 10 Tausenden von unterschiedlichem enthalten klont. Andere Male, möchten wir ein bestimmtes DNA aclone bilden, das ein DNA Exemplar von gerade einem mRNA enthält. Diese Technik, die wir verwenden, hängt im Teil ab, auf dem von diesen Zielen wir erzielen möchten.

DNA Bibliotheken

Wenn wir eine DNA Bibliothek aufbauen möchten, können wir eine einfache aber wirkungsvolle Strategie verwenden, die auf einer benannten Einschnittprozeßübersetzung beruht. Das Wesentliche der Einschnittübersetzung ist der simultane Abbau von DNA vor einem Einschnitt (ein einzeln-angeschwemmter DNA Bruch) und Synthese von DNA hinter den Einschnitt. Der Nettoertrag soll bewegen, oder übersetzen Sie den Einschnitt ' Richtung im 5'-3. Das Enzym, das wir normalerweise die Einschnittübersetzung verwenden, ist E.coli DNA Polymerase I, die ' exonuclease ein 5'-3 Aktivität hat, die das Enzym DNA vor dem Einschnitt vermindern läßt, während er entlang bewegt.

Das zentrale Teil jede mögliche DNA Klonenprozedur ist Synthese der DNA von einer mRNA Schablone mit Rücktranscriptase. Rücktranscriptase ist wie jedes mögliches andere DNA-SYNTHETISIERENDE Enzym ist, daß es nicht DNA Synthese ohne eine Zündkapsel initialisieren kann. Um um dieses Problem zu erhalten, ziehen wir Nutzen aus dem poly(A) Endstück an den 3'-Enden der meisten eukaryotic mRNAs und benutzen oligo(dT) als die Zündkapsel. Das oligo(dT) ist zum poly(A) ergänzend, also bindet es an das poly(A) an den 3'-Enden des mRNA und bereitet DNA Synthese mit dem mRNA als Schablone vor.

Nachdem das mRNA kopiert worden ist, eine einzeln-angeschwemmte DNA (die "erste Faser") erbringend, vermindern wir teilweise das mRNA mit Ribonuclease H (RNase H). Dieses Enzym vermindert die RNS-Faser eines RNA/DNA Mischlings, gerade was wir benötigen, um anzufangen, die RNS von unserer ersten Faser DNA zu verdauen. Die restlichen RNS-Fragmente dienen wie Zündkapseln für das Bilden der "zweiten Faser," mit der ersten als die Schablone. Dieses ist die Einschnitt-Übersetzung Phase des Prozesses und wieder, ist E. Coli DNA Polymerase I das Enzym, das wir pflegen, die Einschnitt-Übersetzung Reaktion durchzuführen. Der Nettoertrag ist eine double-stranded DNA mit einem kleinen Fragment von RNS an den 5'-Enden der zweiten Faser.
Unsere folgende Aufgabe ist, die DNA zu einem Vektor zu verbinden. Dieses war mit unseren Stücken genomic DNA zerspaltet mit Beschränkung Enzymen einfach, aber DNAS haben keine klebrigen Enden. Wir können die stumpfen zusammen verbinden Enden, obwohl der ein verhältnismäßig wirkungsloser Prozeß ist. Jedoch wenn wir die leistungsfähige Verbindung wünschen, die durch klebrige Enden geleistet wird, können wir klebrige Enden (oligo[dC ]) auf die DNA mit einem Enzym anheften, das Terminaldeoxynucleotidyl Transferase (TdT) genannt wird oder einfach Terminaltransferase und eins der deoxribonucleoside Triphosphate. Im Fall verwenden wir dCTP. Das Enzym fügt dCMPs hinzu, einzeln, dem 3'-ends der DNA. In der gleichen Methode bringen wir oligo(dG) Enden zu unserem Vektor an und erlauben das oligo (zu den oligo(dG)s zu tempern die dC)s. Dieses holt den Vektor und die DNA zusammen ist in eine recombinant DNA, die direkt für Transformation benutzt werden kann. Die niedrige Paarung zwischen den Oligonucleotideendstücken ist genug stark, daß keine Verbindung vor Transformation benoetigt wird. Der DNA Ligase innerhalb der umgewandelten Zellen führt schließlich die Verbindung durch.

Sehen Sie das DNA Molekül in 3-Dimensions

Desoxyribonukleinsäure

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