DNA Klonen

DNA Klonen-Forum-Themen

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Antarktisches Phosphatase DNA Klonen dnamolecule	03-24-2008 02:03 P.M. durch JO18 "	1	360
Blaue Weiße Klonen-Auswahl-Positiv-Kolonien liono	02-20-2008 08:45 MORGENS durch Priyanka "	1	598
Stumpfe Ende Klonen DNA pipette_man	01-23-2008 04:17 MORGENS durch postdock "	2	459
Klonen DNA biojoe	05-16-2007 06:30 P.M. durch biojoe "	0	899
Klonen DNA biojoe	12-31-1969 11:00 P.M. durch "	0	82
Klonen von PCR pipette_man	03-28-2008 10:58 MORGENS durch serenacorallini "	3	511
Klonenvektor aftabac	07-19-2007 04:53 MORGENS durch aftabac "	0	538
Ich suche einen Doktor oder jedermann, die alles über Klonen!! weiß! Rocky89	06-04-2008 12:46 MORGENS durch Rocky89 "	5	97
Notwendigkeit help!!molecular Klonen bsengez	11-12-2007 07:44 P.M. durch bsengez "	4	557
Keine Kolonien, die Vektorkompetente Zellen Klonen princezz	01-24-2008 03:27 P.M. durch princezz "	2	256
PCR "Klonen" würde dieses möglich sein? Ammie	09-17-2007 04:16 P.M. durch danfive "	1	304
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Klonende Einsätze in Plasmide

DNA Klonen-Protokoll

Um Sie zu klonen benötigen Sie das folgende:

Vector DNA oder Ihr Plasmidkonstruieren

Vektor-DNA kann sein:
Vektor- oder Plasmid DNA (die sein muß

Um Sie zu klonen benötigen Sie mindestens einige Mikrogramme (3-5 oder mehr) Ihrer Vektor-DNA.

Setzen Sie DNA ein (DNA, die Sie in das Plasmid oder in den Vektor einsetzen möchten)

Einsatz DNA kann sein:
Oligonucleotide-Einsatz (oligos mit den Beschränkung Schnitt Hälfte-Sites getempert und phosphoryliert mit PNK)
Beschränkung Enzym Festgelegter Einsatz
PCR Einsatz (PCR mit Sites des Beschränkung Enzym-Schnittes (die vollständige Site ist! erforderlich) im Ende’ 5 der Zündkapsel)

Wenn der Einsatz, den Sie klonen möchten, weniger als ist, 60 BP, können Sie Oligonucleotides bestellen und sie zusammen tempern.

Wenn Ihre Einsatz DNA Größe (weniger BP als 1000) klein ist, benötigen Sie nicht theoretisch so viel DNA wie Ihr Vektor. Wenn Ihre Einsatz DNA Größe (10-200 BP) klein ist, benötigen Sie sehr wenig dieser DNA theoretisch.

Im allgemeinen sollten Sie mindestens 1 Mikrogramm des Beginnens von von Einsatz DNA haben.

Vorbereiten von von Vektor-DNA für Klonen: Mini-Vorbereitung, Midi-Vorbereitung, Maxi-Vorbereitung

Wir fanden, daß die einfachste Methode, DNA vorzubereiten einen Installationssatz Mini-Vorbereitung (Qiagen) benutzt. Wir benutzen einige Spalten für das gleiche Vektor-DNA Konstruieren.

Für jede Spalte fügen wir ungefähr 4 ml lbs gewachsenes Bakterium hinzu (wir fügen 2 ml lbs Bakteriumsuppe einem ein 2 ml eppendorf Gefäß hinzu und spinnen zweimal = 2 x 2 ml = 4 ml)

Spitze: Wachsen Sie immer ungefähr 5 ml lb.in. der 15 ml Falke-Gefäße, halten das 1 ml, wie Bakterium eines Glycerins gefrorenes in der 80 – C Gefriermaschine auf Lager.

Wie man ein Glycerin bakteriellen Vorrat für die 80 – C Gefriermaschine, die für Jahre hält (Sie, muß nie Platten streifen oder kompetente Zellen wieder bilden bildet! – sichert Sie Zeit)

Fügen Sie einfach das 50% Glycerin Ihrem bakteriellen Wachstum lbs hinzu. Dieses muß nicht genaues IE sein, wenn Sie mit ungefähr 1 ml bakteriellem lbs hinzufügen ungefähr 500 ul von Glycerin 100% und einfrieren in den 80 C – gelassen werden.

Nachdem wir jede Spalte mit ungefähr 50 ul von EB (Eluierungbuffer, Qiagen, Tris Buffer – enthält NICHT EDTA), eluiert haben, vereinigen wir die Eluate so, daß wir herum 200 ul bis 400 ul haben (oder 4 – 8 Spalten pro Konstruieren oder Vektor). Dieses ist gibt genügend beginnende Vektor-DNA für Klonen.

Anmerkung: wir fanden, daß das EDTA in TE folgende Beschränkung Verdauung der eluierten DNA von Mini-Vorbereitung und von anderen Plasmidreinigunginstallationssätzen hemmt.

Vorbereiten von von Einsatz DNA für Klonen

Setzen Sie DNA muß sein ein

Beschränkung Enzym-Verdauung und Ausschnitt Ihr Plasmid-Vektor für DNA Klonen

Plasmidvektor wird normalerweise geschnitten.

Verbindung des Einsatzes und des Vektors

Um Einsatz Vector zu verbinden, verwenden Sie 200 ng des Vektors als Anleitung (Leute verwenden so wenig wie 50 ng – N.E.B Handbuch).

Setzen Sie ng = vektorng ein
Setzen Sie Größe vektorgröße ein

Einen 500 BP Einsatz in einen 5000 BP Vektor folglich verbinden, den Sie benötigen würden

Setzen Sie ng = 200 ng X 500 ein
5000

Setzen Sie ng = 20 ng des Einsatzes benötigt für 1 ein: 1 Verbindung

Für einen Einsatz 3: 1 vektorverbindung, die Sie benötigen würden: 60 ng

Verbindung

Ul X    DNA Vektor 200 ng
Y ul     Einsatz (errechneter ng)
2 ul 10 X Buffer
1 ul T4 DNA Ligase NEB
zu 20 ul     H20
--------
20 ul   Gesamtmenge

Nehmen Sie 5 ul der Verbindung und fügen Sie 100 ul AVW 5 der Alphazellen Invitrogen hinzu
(Subcloning Leistungsfähigkeit O.K., eins besser gut geschossen, maximale Leistungsfähigkeit – für harte Verbindungen aber kostspielig).

Erhitzen Sie Schlag
Fügen Sie 250 ul von Soc kompetenten Zellen hinzu

Überziehen Sie GESAMTE Menge auf Platte.

Wachsen Sie overnite bei 37 C

Schicken Sie einem Freund diese Seite

Spezifizieren Sie: Vektorgröße: BP
Spezifizieren Sie: Einsatzgröße: BP
Verhältnis: (Molen von Einsatz DNA pro Mole von Vektor-DNA)

Für ng Vektor-DNA, fügen hinzu ng Einsatz DNA.

Bioinformatics, Protokolle, DNA RNS Protein Proteomics

Intrazelluläre Stationen