ZelleTransfection

Transfection beschreibt die Einleitung des Fremdmaterials in eukaryotic Zellen unter Verwendung eines Virusvektors oder andere Mittel der Übertragung.

Der Ausdruck Transfection für nicht-Virenmethoden ist in der Referenz auf Säugetier- Zellen häufig am benutztesten, während die Ausdrucktransformation bevorzugt wird, um nicht-Viren-DNA-Übertragung im Bakterium und in den nicht tierischen eukaryotic Zellen wie Pilzen, Algen und Anlagen zu beschreiben.

Transfection der Tierzellen bezieht gewöhnlich mit ein, vorübergehende Poren oder „Löcher“ in der Zellenplasmamembrane zu öffnen, um das Heben des Materials zu erlauben. Genetisches Material (wie supercoiled Plasmid DNA-oder siRNA Konstruieren) oder sogar Proteine wie Antikörper, können transfected. Zusätzlich zum Electroporation kann Transfection durchgeführt werden, indem man ein kationisches Lipid mit dem Material mischt, um Liposome zu produzieren, die mit der Zellenplasmamembrane fixieren und ihre Ladung nach innen niederlegen.

Die ursprüngliche Bedeutung von Transfection war „Infektion durch Transformation“, d.h. Einleitung von DNA (oder von RNS) von einem Eukaryotevirus oder -bakteriophage in Zellen, mit dem Ergebnis einer Infektion. Weil die Ausdrucktransformation eine andere Richtung in der Tierzellenbiologie (eine genetische Änderung, langfristige Ausbreitung erlaubend in der Kultur oder im Eigentumserwerb typisch von den Krebszellen) hatte, erwarb der Ausdruck Transfection, für Tierzellen, seine anwesende Bedeutung einer Änderung in den Zelleneigenschaften, die durch Einleitung von DNA verursacht wurden.

Transfection ist eine Methode, durch die experimentelle DNA in eine kultivierte Säugetier- Zelle gesetzt werden kann. Solche Experimente werden normalerweise unter Verwendung geklonter DNA durchgeführt, die codierte Befehlsfolgen und Steuerregionen (Förderer, usw.) enthält um zu prüfen ob die DNA ausgedrückt wird. Da die geklonte DNA weitgehend geändert worden sein kann (z.B., können verbindliche Sites des Proteins auf dem Förderer geändert worden sein oder gelöscht worden sein), ist Transfection häufig benutzt zu prüfen, ob eine bestimmte Änderung die Funktion eines Gens beeinflußt.

Transfection-Diagramm:

Transfection-Anwendungen

Die Fähigkeit, RNS im Labor zu synthetisieren ist zu vielen Techniken kritisch. Radioaktive und nicht-radioaktive RNS-Prüfspitzen werden für viele Protokolle benötigt, und sie können Kleinin den in-vitroübertragungreaktionen leicht synthetisiert werden, ihren Gebrauch in den Fleckhybridationen und in den Nukleaseschutzproben erlaubend.

• Vektor oder DNA
• Zellen
• Transfection-Reagens

In-vitroübertragung benötigt eine gereinigte lineare DNA-Schablone, die einen Förderer, Ribonucleotidtriphosphate, ein Buffersystem enthält, das DTT und Magnesium umfaßt

In-vitroübertragung benötigt eine gereinigte lineare DNA-Schablone, die einen Förderer, Ribonucleotidtriphosphate, ein Buffersystem enthält, das DTT und Magnesium umfaßt

Transfection-Methoden

Es gibt verschiedene Methoden der Einführung fremder DNA in eine eukaryotic Zelle. Viele Materialien sind als Fördermaschinen für Transfection benutzt worden, der in drei Arten unterteilt werden kann: (kationische) Polymer-Plastiken, Liposome und nanoparticles.

Eine der preiswertesten (und wenige zuverlässige) Methoden ist Transfection durch das Kalziumphosphat, ursprünglich entdeckt durch F.L. Graham und A.J. van Der Eb 1973 [das Zitieren benötigt] (sehen Sie auch [1]). die HEPES-gepufferte salzige Lösung (HeBS) Phosphationen enthalten wird mit einer Kalziumchlorverbindungslösung kombiniert, welche die transfected enthält DNA. Wenn die zwei kombiniert werden, bildet bindet sich ein feiner Niederschlag des positiv - belastetes Kalzium und negativ - belasteten Phosphats und die auf seiner Oberfläche transfected DNA. Die Aufhebung des Niederschlags wird dann den transfected hinzugefügt Zellen, (normalerweise eine Zellkultur gewachsen in einem monomolekularen Film). Durch einen Prozess nicht völlig verstanden, nehmen die Zellen etwas von dem Niederschlag und mit ihm, die DNA auf.

Andere Methoden benutzen vielästige organische Mittel, so genannte dendrimers, um die DNA zu binden und sie in die Zelle zu kommen. Eine sehr leistungsfähige Methode ist die Einbeziehung der in den Liposomen, d.h. die kleinen, Membrane-gesprungenen Körper transfected DNA, die irgendwie der Struktur einer Zelle ähnlich sind und mit der Zellenmembrane wirklich fixieren können und gibt die DNA in die Zelle frei. Für eukaryotic Zellen wird das gegründete Lipidkation Transfection gewöhnlich benutzt, weil die Zellen empfindlicher sind.

Eine andere Methode ist der Gebrauch der kationischen Polymer-Plastiken wie Deae-Dextran oder polyethylenimine. Negativ - belastete DNA bindet an das polycation und der Komplex wird durch die Zelle über endocytosis aufgenommen.

Eine direkte Annäherung an Transfection ist die Gengewehr, in der die DNA zu einem nanoparticle eines trägen Körpers verbunden wird (geläufig Gold) der dann direkt in den Kern der Zielzelle „geschossen“ wird. DNA kann in Zellen unter Verwendung der Viren als Fördermaschine auch eingeführt werden. In solchen Fällen wird die Technik Virentransduction genannt, und, die Zellen sollen transduced.

Andere Methoden von Transfection umfassen nucleofection, Electroporation, Hitzeschlag, magnetofection und eigene Transfectionreagenzien wie Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene oder DreamFect.

Stall gegen vorübergehende Transfection-Methoden

Für die meisten Anwendungen von Transfection, ist es genügend, wenn das transfected Gen nur vorübergehend ausgedrückt wird. Da die DNA, die im Transfectionprozeß eingeführt wird, normalerweise nicht in das Kerngenom eingesetzt wird, ist die fremde DNA am späten Zeitpunkt verloren, wenn die Zellen Mitose durchmachen. Wenn es gewünscht wird, dass das transfected Gen wirklich im Genom der Zelle und seiner Tochterzellen bleibt, muss ein beständiger Transfection auftreten.

Um dieses zu vollenden, ist ein anderes Gen Co-transfected, die der Zelle etwas Auswahlvorteil gibt, wie Widerstand in Richtung zu einem bestimmten Giftstoff. Einige (sehr wenige) der transfected Zellen haben zufällig das fremde genetische Material in ihr Genom eingesetzt. Wenn der Giftstoff, in Richtung zu dem das Gen Co-transfected Widerstand leistet, dann der Zellkultur hinzugefügt wird, nur jene wenigen Zellen mit den fremden Genen, die in ihr Genom eingesetzt werden, sind sich stark zu vermehren, während andere Zellen sterben. Nachdem sie eine Zeitlang diesen Auswahldruck, nur angewendet haben, die Zellen mit einem beständigen Transfection bleiben und können weiter kultiviert werden.

Ein geläufiges Mittel für beständigen Transfection ist Geneticin, alias G418, das ein Giftstoff ist, der durch das Produkt des beständigen Gens des Neomycins neutralisiert werden kann.

In-vitroübertragung benötigt eine gereinigte lineare DNA-Schablone, die einen Förderer, Ribonucleotidtriphosphate, ein Buffersystem enthält, das DTT und Magnesium umfaßt

Spitzen für Transfection

• Benutzen Sie RNasehemmnisse immer!
• Einsparung-Geld mit RNS T7 Bakteriophagenpolymerase: Klone mit einer N-Terminal His-6 Marke sind vorhanden. Wenn Sie diesen Klon erhalten, können Sie große Mengen der Polymerase T7 mit hoher Aktivität reinigen (Referenz: Er B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister GEWICHT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Um die DNA-Schablone zu löschen, benutzen Sie eine RNase-freie DNAse. Wir haben die DNAse RQ1 (Promega) hinzugefügt für 15 Minuten benutzt und es funktioniert gut. 

Speichern des Trasfection Reagens

• RNS wird gut bei einem Nullph mit EDTA gespeichert.
• TE Buffer wird (10 Millimeter Tris-HCl-, pH-7.5, 1 Millimeters von EDTA) empfohlen, gleichwohl dieses mit der frei gereinigten worden RNase vorbereitet werden sollte (preferablly Nesselkorallewasser).

Störungssuchetransfection-Probleme

Ausfallen Transfections

• Altes Transfectionreagens
• Unsachgemäß gespeichertes Transfectionmittel
• Geringe Qualität DNA oder Vektor
• Unzulängliche DNA-Menge
• Unzulängliches Transfectionreagens
• Zu viel DNA
• Zu viel Transfectionreagens

Referenzen auf Transfection

Referenzen auf Transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). „Übertragung des Gens für Thymidinkinase auf Kinase-unzulängliche menschliche Zellen des Thymidins durch gereinigte Herpessimplexbetrieb Viren-DNA“. Proc nationales Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108.