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Mykoplasma-Verschmutzung & Zellkultur

Wir schließen hier zu Zellkulturlabors, Information über Mykoplasmaverschmutzungen und den neuesten Mykoplasmaforumdiskussionen für alle Ihre Verschmutzung Fragen und Diskussionen ein.

Mykoplasma-Hintergrund

Mycoplasmas sind eine Klasse des Bakteriums, das eine Zellwand ermangeln. Wegen eines Fehlens von einer Zellwand, sind es gegen viele Antibiotika einschließlich Penicillin oder andere Beta-Laktam Antibiotika beständig, die Zellwandsynthese zielen.

Mykoplasma sind entweder parasitsch oder saprophytisch. Einiges Krankheit-verursachen Mykoplasma in den Menschen, einschließlich M. pneumoniae, das eine wichtige Ursache der atypischen Pneumonie und anderer Atmungsstörungen ist, und M. genitalium, das geglaubt wird, in Becken- entzündliche Krankheiten mit einbezogen zu werden. Sie können zu etwas Krebsen verursachen oder beitragen.

Klasse Mykoplasma

Die Klasse Mykoplasma ist eine einiger Klassen innerhalb der Kategorie Mollicutes. Mollicutes sind Bakterium, die kleine Genome haben, eine Zellwand ermangeln und einen niedrigen Gaschromatographie-Inhalt (18-40 %). haben

Es gibt über 100 anerkannten Sorten Klasse Mykoplasma. Ihre Genomgröße reicht von 0.58 1.38 Megabasepaaren. Mollicutes sind Parasiten oder commensals der Menschen, der Tiere (einschließlich Insekte) und der Betriebe; die Klasse Mykoplasma ist durch die Definition, die auf vertebrate Hauptrechner eingeschränkt wird. Cholesterin wird für das Wachstum der Sorte der Klasse Mykoplasma sowie bestimmte andere Klassen von mollicutes benoetigt. Ihre optimale Wachstumtemperatur ist häufig die Temperatur ihres Hauptrechners, wenn (z.B. 37 Grad Celsius in den Menschen) oder umgebende Temperatur warmbodied, wenn der Hauptrechner nicht imstande ist, seine eigene interne Temperatur zu regeln. Analyse der ribosomal Reihenfolgen der RNS 16S sowie Geninhalt schlagen stark vor, daß die mollicutes, einschließlich die mycoplasmas, nah entweder mit dem Milchsäurebazillus oder dem Clostridiumzweig des phylogenetischen Baums zusammenhängen (Firmicutes sensu stricto).

Zelle Zeilen und Mycoplasmas

In den Zellkulturen können mycoplasmas zellulare Änderungen, einschließlich Chromosom aborations, Änderungen im Metabolismus und Zelle Wachstum verursachen. Strenge Mykoplasmainfektion kann eine Zelle Zeile zerstören oder die kostspieligen oder kostbaren unbrauchbaren Zelle Zeilen übertragen.

Zellkultur-Verschmutzung mit Mykoplasma

Mycoplasmas werden häufig in den Forschung Labors wie Verschmutzer in der Zellkultur gefunden. Mykoplasmale Zellkulturverschmutzung tritt wegen der Verschmutzung von den Einzelpersonen oder von verschmutzten Zellkulturmediumbestandteilen auf.

Mykoplasma-Abfragung Methoden

Mykoplasmazellen sind normalerweise kleiner als 1 µm und folglich ziemlich schwierig, mit herkömmlichen Mikroskopiemethoden zu entdecken. Abfragung Techniken schließen ein:

• PCR
• Echtzeit-PCR
• Überzug auf empfindlichem Nährboden
• DNA Flecke einschließlich DAPI oder oder Hoescht Fleck

Hoechst Fleck-Mykoplasma-Verschmutzung Abfragung Protokoll

Ein Hoechst (Sigma, Katalog #:H6024) Methode für Mykoplasma befleckend:

1. Für anhaftende Zellen legen Sie ein steriles Abdeckungglas in Petrischale. Fügen Sie 2-3 Tropfen der Zelle Aufhebung mitten in coverglass hinzu (abhängig von der Wachstumsrate Ihrer Zellen).
2. Dann fügen Sie sorgfältig 2-3 ml des Mediums hinzu, ohne die Zellen zu stören. Wachsen Sie die Zellen, bis sie 50 -70% confluent sind.

Regelnzellen:

1. Bereiten Sie Zelle Fixiermittel vor, das ein Mischung fo 3:1 Methanol ist: Glazial- Essigsäure (M:AA). Stellen Sie, dieses vorzubereiten sicher, das vor Gebrauch frisch ist.
2. Verwerfen Sie Medium von wachsenden Zellen. Fügen Sie 2 ml des Methanols hinzu: Glazial- Lösung der Essigsäure M:AA tropfenweise auf die Seite der Platte (nicht direkt auf die Zellen). Wirbeln die Platte und verwerfen Lösung.
3. Fügen Sie 2 ml M:AA hinzu, wirbeln Sie und verlassen Sie an für 2-3 Minuten bei der Raumtemperatur.
4. Ausschuß M: AA Lösung und Spülen mit Wasser
5. Verlassen Sie auf lagerkonzentration des Luft zur trockenen (Sie können die Platte halten, bis Sie sind betriebsbereit zu beflecken), Hoecht Flecks (Katze # 33258 vom Sigma) = 0.1 mg/ml im Wasser, das Sie filtern können entkeimen gegenwärtig mit 0.2uM, Filter Verpackung Behälter im Aluminiumfolie Speicher bei 4 oC der Arbeitslösung frisches jede Zeit wie benötigt bilden die 1:1000 Verdünnung (0.1 µg/ml) vom Vorrat im Wasser vorbereiten

Beflecken Der Zellen:

1. Fügen Sie genügend Hoechst Fleck hinzu, um den gesamten Abdeckungbeleg (Gebrauch 1-2ml zu umfassen für eine kleine Petrischale).
2. Lassen Sie den Fleck an für 45 Minuten - 1 Stunde (in der Dunkelheit).
3. Spülen Sie gut mit Wasser aus.
4. Hängen Sie an einem Mikroskopplättchen ein (mountant Mischung: 22 Millimeter Zitronensäure; 55.6 Millimeter Binatriumphosphat; 50% Glycerin, pH Mischung 5.5) zum Platz ein Tropfen oder zwei auf Abdeckungbeleg (Zellen oben) und Platzabdeckungbeleg (Zellen unten) auf Plättchen.
5. Machen Sie unter Fluoreszenzmikroskop sichtbar

Anmerkung: speichern Sie Hoechst Fleck an 4oC mindestens oder Aliquote in die Gefriermaschine für langfristige Lagerung.