Mykoplasma-Verschmutzung & Zellkultur

Mycoplasmas sind eine Klasse des Bakteriums, das eine Zellwand ermangeln. Wegen eines Fehlens von einer Zellwand, sind es gegen viele Antibiotika einschließlich Penicillin oder andere Beta-laktam Antibiotika beständig, die ZielZellwandsynthese.

Mykoplasma sind entweder parasitsch oder saprophytisch. Einiges Krankheit-verursachen Mykoplasma in den Menschen, einschließlich M. pneumoniae, das eine wichtige Ursache der atypischen Pneumonie und anderer Atmungsstörungen ist, und M. genitalium, das geglaubt wird, in Becken- entzündliche Krankheiten mit einbezogen zu werden. Sie können zu etwas Krebsen verursachen oder beitragen.

Klasse Mykoplasma

Die Klasse Mykoplasma ist eine einiger Klassen innerhalb der Kategorie Mollicutes. Mollicutes sind Bakterium, die kleine Genome haben, eine Zellwand ermangeln und einen niedrigen Gaschromatographie-Inhalt haben (18- 40%).

Es gibt über 100 anerkannten Sorten Klasse Mykoplasma. Ihre Genomgröße reicht von 0.58 1.38 Megabasepaaren. Mollicutes sind Parasiten oder Commensals der Menschen, der Tiere (einschließlich Insekte) und der Anlagen; die Klasse Mykoplasma wird per Definition auf fest gefügte Hauptrechner eingeschränkt. Cholesterin wird für das Wachstum der Sorte der Klasse Mykoplasma sowie bestimmte andere Klassen von mollicutes benötigt. Ihre optimale Wachstumtemperatur ist häufig die Temperatur ihres Hauptrechners, wenn sie (z.B. 37 Grad Celsius in den Menschen) oder umgebende Temperatur warmbodied, wenn der Hauptrechner nicht imstande ist, seine eigene interne Temperatur zu regeln. Analyse der ribosomalen Reihenfolgen der RNS 16S sowie Geninhalt empfehlen nachdrücklich, dass die mollicutes, einschließlich die mycoplasmas, entweder zum Milchsäurebazillus oder zum Clostridiumzweig des phylogenetischen Baums eng verwandt sind (Firmicutes sensu stricto).

Zellformen und Mycoplasmas

In den Zellkulturen können mycoplasmas zellulare Änderungen, einschließlich Chromosom aborations, Änderungen im Metabolismus und Zellenwachstum verursachen. Strenge Mykoplasmainfektion kann eine Zellform zerstören oder die teuren oder kostbaren unbrauchbaren Zellformen übertragen.

Zellkultur-Verschmutzung mit Mykoplasma

Mycoplasmas werden häufig in den Forschungslabors wie Verschmutzer in der Zellkultur gefunden. Mykoplasmale Zellkulturverschmutzung tritt wegen der Verschmutzung von den Einzelpersonen oder von verschmutzten Zellkulturmediumbestandteilen auf.

Mykoplasma-Abfragungs-Methoden

Mykoplasmazellen sind normalerweise kleiner als 1 µm und folglich ziemlich schwierig, mit herkömmlichen Mikroskopiemethoden zu entdecken. Abfragungstechniken umfassen:

• PCR
• Echtzeit-PCR
• Überzug auf empfindlichem Nährboden
• DNA-Flecke einschließlich DAPI oder oder Hoescht Fleck

Hoechst beflecken Mykoplasma-Verschmutzungs-Abfragungs-Protokoll

Ein Hoechst (Sigma, Katalog #: H6024), das Methode für Mykoplasma befleckt:

1. Für anhaftende Zellen legen Sie ein steriles Abdeckungglas in Petrischale. Fügen Sie 2-3 Tropfen der Zellenaufhebung mitten in coverglass hinzu (abhängig von der Wachstumsrate Ihrer Zellen).
2. Dann fügen Sie sorgfältig 2-3 ml des Mediums hinzu, ohne die Zellen zu stören. Wachsen Sie die Zellen, bis sie 50 -70% zusammenfließend sind.

Festlegung-Zellen:

1. Bereiten Sie Zelle Fixiermittel vor, das ein Mischungs-FO-3:1 Methanol ist: Glazial- Essigsäure (M: AA). Stellen Sie Sie sicher, dieses frische vor Gebrauch vorzubereiten.
2. Verwerfen Sie Medium von den wachsenden Zellen. Fügen Sie 2 ml des Methanols hinzu: Glazial- Essigsäure M: AA-Lösung tropfenweise auf die Seite der Platte (nicht direkt auf die Zellen). Wirbeln die Platte und verwerfen Lösung.
3. Fügen Sie 2 ml von M hinzu: AA, Strudel und Urlaub an für 2-3 Minuten bei Zimmertemperatur.
4. Ausschuss M: AA-Lösung und Spülen mit Wasser
5. Verlassen Sie auf lagerkonzentration des Luft zur trockenen (Sie können die Platte halten, bis Sie sind betriebsbereit zu beflecken), Hoecht Flecks (cat# 33258 vom Sigma) = 0.1 mg/ml im Wasser, das Sie unter Verwendung eines Filter 0.2uM Verpackungsbehälters im Aluminiumfolie Speicher bei 4 Oc gegenwärtig filtersterilisieren können, Funktionslösung frisches jedes Mal bilden falls erforderlich 1:1000verdünnung (0.1 µg/ml) vom Vorrat im Wasser vorbereiten

Beflecken der Zellen:

1. Fügen Sie genügend Hoechst-Fleck hinzu, um den gesamten Abdeckungbeleg (Gebrauch 1-2ml zu umfassen für eine kleine Petrischale).
2. Lassen Sie den Fleck an für 45 Minuten - 1 Stunde (in der Dunkelheit).
3. Spülen Sie gut mit Wasser aus.
4. Hängen Sie an einem Mikroskopplättchen ein (mountant Mischung: 22 Millimeter Zitronensäure; 55.6 Millimeter Binatriumphosphat; 50% Glyzerin, pH-Mischung zu) Platz 5.5 ein Tropfen oder zwei auf Abdeckungbeleg (Zellen oben) und Platzabdeckungbeleg (Zellen unten) auf Plättchen.
5. Machen Sie unter Fluoreszenzmikroskop sichtbar

Anmerkung: speichern Sie Hoechst-Fleck an 4oC mindestens oder Aliquote in die Gefriermaschine für langfristige Lagerung.