Ganz über polyclonal Antikörper.
Polyclonal Antikörper-In Verbindung stehende Externe
Betriebsmittel - Protokolle:
Auch Besuch Antikörper- Station für mehr auf
Polyclonal Antikörpern. Es ist eine neue
Site, die Antikörperlieferanten ausdruckt, erlernt über Antikörper
und Protokolle.
Polyclonal Antikörperprotokolle:
Polyclonal Antikörper
Polyclonal Antikörper sind
die Antikörper, die von vielen B-Zellen oder von B-Zelle Zeilen,
ähnlich sind der Mischung der Antikörper berechnet werden, die in
den Blutseren gefunden werden.
Polyclonal Antikörper sind folglich eine Mischung vieler
unterschiedlicher Antikörperbesonderheiten.
Die gekauften Polyclonal Antikörpervorbereitungen sind
Mischungen der Antikörper vieler unterschiedlicher Besonderheiten zum
gleichen Antigen.
Immunisierung eines Kaninchens, der Maus, der Ziege, des
Huhns oder anderen Tieres produziert polyclonal Antikörper.
Tierseren können direkt benutzt werden, gleichwohl es besser
ist, polyclonal Antikörper für Laborverbrauch zu reinigen.
Polyclonal Antikörper-Vorbereitung
Gegründet auf dem Protokoll durch Dr. David
Bowtell
Immunisierung der Mäuse:
Die Einspritzungen, zum der Mäuse für das Erzeugung der
polyclonal Antikörper zu immunisieren sollten in Abständen von
mindestens zwei Wochen getrennt gebildet werden.
Die folgenden 2 Hilfen sind erfolgreich gewesen:
- Freund Hilfe und MPL+TDM Hilfe (RIBI ImmunoChem Research,
Inc.). Mpl ist weniger gefährlich als die erste Hilfe.
- Für die erste Immunisierungeinspritzung: spritzen
Sie 15 - 50 ug wenn Antigen in der UL 200 Hilfe ein, subkutan
eingespritzt.
- Die zweite Einspritzung sollte später auftreten 2 Wochen;
Sie müssen mit 15 - 50 ug des Antigens in der Hilfe dann
aufladen. (wenn Zeit ermöglicht, laden Sie wieder ein Monat
später auf).
- Sieben bis 10 verlaufen Tage später das Mäuse- und
Testserum mit der Probe, die für Siebung verwendet wird. Wenn
Titer nicht stark genug ist, Erhöhung wieder zwei Wochen nach
vorhergehender Erhöhung.
OBERSEITE
Serum-Vorbereitung:
- Nachdem man gesammelt hat sollte Blut für 60 Minuten
gerinnen lassen werden. an 37°C oder an O.N an 4°C.
- Trennen Sie den Klumpen von den Seiten des Gefäßes
(Klingeln) eine pasteur Pipette verwendend. Plazieren Sie
Klumpen an 4°C O.N.
- Spinnen Sie bei 10000 x g für 10 Min. an 4°C, um das
Serum zu trennen.
- Serum kann an -20°C gespeichert werden, nachdem man
Glycerin 50% hinzugefügt hat.
Wenn monoclonal, werden Antikörper gewünscht, sobald Sie
ein "gutes" polyclonal und eine zuverlässige Siebmethode zum
folgenden Jobstep fortfahren lassen.
OBERSEITE
Kaninchen:
Kaninchen werden im Wesentlichen immunisiert, wie oben
beschrieben. Einspritzungen:
- Zuerst Freunds in der kompletten Einspritzung
100-200ug/1ml, zwei Sites (über jeder Schulter).
- An zweiter Stelle 1 Monat später in Freunds
UNVOLLSTÄNDIG als oben.
- Blutung 2 Wochen später. Erhöhung 2 Wochen später
wieder (2 + 2 Woche Schleife).
OBERSEITE
PRODUKTION DER POLYCLONAL ANTIKÖRPER IN DEN
KANINCHEN (NEUSEELAND WEISS)
Gegründet auf dem Protokoll durch Dr.Walter
Steffen.
Die Kaninchen sollten 3-4 Kilogramm Gewicht und in
ungefähr 3 im Monaten sein alt. Über einen Third des
Kaninchens haben Sie endogene Anti-Keratin Antikörper und
immunoactivity für viele zellulare Bestandteile. Dieses hebt
den Wert des Nehmens des vor-immunen Serums von jedem möglichem
gegebenen Kaninchen hervor.
Buffer und Lösungen:
- Gesättigte Ammoniumsulfatlösung, 2 Millimeter EDTA, pH
8.0
- 50 des AmmoniumMillimeter azetats, pH 8.0
- 70% Äthanol
- Hilfe Freunds (komplett u. unvollständig)
- Phosphat gepuffertes salziges (PBS) (sehen Sie
unten)
- Vaseline
- Xylen
OBERSEITE
- Holen Sie das Kaninchen von seinem Rahmen und
legen Sie es sicher in einen zurückhaltenen Kasten, der das Ohr
zugänglich verläßt. Halten Sie die Ruhe des Kaninchens
verhältnismäßig. Datenträger Blut bis 50 ml können von der
Hauptarterie leicht gesammelt werden, die hinunter die Mitte der
dorsalen Oberfläche des Ohrs läuft.
- Rasieren Sie linkes Ohr um linke Ader mit einer frischen
Rasierklinge.
- Wischen Sie Ohr mit dem 70% Äthanol oder dem Isopropanol
auf.
- Wischen Sie Ohr mit Xylen um Arterie-Ader Schleife auf, um
sich zu weiten.
- Halten Sie die Spitze des Ohrs (fest) und des Ansammlung
Gefäßes in einer Hand und mit dem freien Handeinsatz eine
hypodermatische Nadel 19G in die geweitete Arterie an. Das Blut
sollte anfangen, sofort in das Ansammlung Gefäß zu fließen.
Für beste Resultate benutzen Sie einen Teil der Arterie mittler
entlang dem Ohr.
- Sammeln Sie bis 50 ml Blut. Wenden Sie den Druck an,
der am Punkt des Eintrages der Nadel zum Endbluten gerade vorhergehend
ist.
- Treffen Sie Vaseline auf Ohr zu, um Xylenentzündung zu
beruhigen.
- Setzen Sie Extravaseline auf Schnitt.
Erhalten Des Serums:
OBERSEITE
- Strudelgefäß mit dem gesammelten Blut, zum der
Oberfläche zu beschichten und des Klumpenzubehörs zum Gefäß zu
verhindern.
- Brüten Sie bei oC 37 1 Stunde lang aus.
- Zentrifugieren Sie bei 2.500 g (#7 in einer klinischen
Tabelle Oberseite einstellend) für 10 Minuten.
- Löschen Sie Klumpen und spinnen Sie Serum bei 3.000 g
für 10 Minuten.
- Serum sollte gespeichert werden eingefroren worden.
Ammonium-Sulfat-Niederschlag von IgG vom Serum (oC 4, durchgeführt im Kühlraum):
Ammoniumsulfatniederschlag ist eine einfache Methode, zum
eines ziemlich reinen IgG Bruches zu erreichen.
OBERSEITE
- Poolserum von einem Kaninchen
- Gewichtserum
W1 = _____ g
- Wäschegefäße mit Minute. PBS und wiegen
wieder.
W2 = _____ g
- Fügen Sie 2/3 Datenträger W2 gesättigtes
Ammoniumsulfat, 2 Millimeter EDTA, pH 8.0 hinzu
Anmerkung: fügen Sie sehr langsam,
tropfenweise, beim Rühren bei oC 4 oder benutzen Sie peristaltische
Pumpe hinzu.
- Rühren Sie sich für 15 Minuten.
- Übertragung auf 40 ml Zentrifugegefäße;
Wäschebecher mit 3 Teilen PBS: 2 Teil fügen
Ammoniumsulfat und Gefäßen hinzu.
- Drehbeschleunigung bei 12.000 g (Beckman JA-20:
10.000 U/min) für 10 Minuten.
- Verwerfen Sie Supernatant.
- Setzen Sie Tablette in PBS erneut aus [ 1/2 W1 = 1/2 Vol..
].
- Spinnen Sie bei 12.000 g für 10 Minuten, verwerfen Sie
Tablette.
- Sammeln Sie Supernatant im Becher, Wäschewände mit PBS.
Stellen Sie W3 = _____ fest
- Fügen Sie 2/3 Vol. hinzu. W3 gesättigtes
Ammoniumsulfat, beim Rühren. Fahren Sie fort, für 15 Minuten
sich zu rühren.
- Übertragen Sie Aufhebung auf 40 ml Zentrifugegefäße,
Wäschegefäß mit PBS/ammonium Sulfatlösung.
- Spinnen Sie bei 12.000 g für 10 Minuten.
- Verwerfen Sie Supernatant.
- Setzen Sie Tabletten in 1/4 W1 PBS erneut aus.
- Dialysieren Sie gegen PBS, 3-times je 6 Stunden.
- Setzen Sie Serum in ein abgestuftes Gefäß,
Spülendialysebeutel gut mit PBS ein.
- Holen Sie bis 1/2 W1 = 1/2 Vol. in PBS.
- Stellen Sie Proteinkonzentration und -aliquote für
Speicherung fest. Messen Sie die Absorption bei 280 nm.
Die Absorption von 1 mg/ml IgG Lösung ist ungefähr 1.5.
Immunisierung:
OBERSEITE
- Lösen Sie ~400-600 g Antigen
(~200-300 g pro Einspritzung) in 2.2 ml 50 Millimeter
Ammoniumazetat, pH 8.0 oder anderes passender Buffer auf.
Konzentration hängt von der Antigenizität des eingespritzt zu
werden ab Proteins.
- Die Menge des Antigens benötigt worden, um ein Tier zu
immunisieren hängt von ihr Antigenizität und die Methode der
Immunisierung ab. Wenn Proteine mit niedriger Antigenizität
benutzt werden, ist es nützlich, das Protein mit einer niedrigen
Konzentration von SDS (bis 0.2%) zu denaturieren. Nur in hohem
Grade gereinigtes Antigen sollte für die Produktion der polyclonal
Antikörper benutzt werden. Eine einfache Methode, zum eines
reinen Antigens zu erhalten ist durch SDS-PAGE. Proteine können
auf ein Blatt der Nitrozellulose übertragen werden, mit Ponceau S
befleckt werden, mit einer Rasierklinge auszuschneiden, und als
Antigen benutzt werden (suchen Sie nach Standardprotokollen in
SDS-PAGE).
- Arbeitn Sie 1.1.ml Freunds komplette Hilfe mit einer
hypodermatischen Nadel 20G aus, dann stellen Sie 1.1 ml der
Antigenlösung auf. Frieren Sie restliche 1.1 ml für Erhöhung
ein.
- Den Spulenkern unbeweglich halten, löschen Sie die Nadel
und bringen Sie einen sterilen Absperrhahn 3-way an.
- Mischen Sie das Antigen mit der Hilfe, indem Sie hin und
her eine zweite Glasspritze zum Absperrhahn anbringen und einspritzen.
(Vorsicht: einige Plastikspritzen konnten mit dem
Mineralöl reagieren.)
- Eine komplette Emulsion wird nach ungefähr 20-30 Minute
gebildet; angezeigt durch eine ziemlich plötzliche Zunahme der
Viskosität der Lösung.
Vorsicht: seien Sie sicher, daß die Montage sicher
ist!
- Nach mischender Wartezeit ungefähr 20 Minuten vor
Einspritzung zur Steuerung, daß Mischung komplett ist (wenn
unvollständig, trennt sich Öl).
- Rasieren Sie zurück vom Kaninchen von Schulterblätter zu
Pelvis.
- Säubern Sie zurück mit dem 70% Äthanol oder dem
Isopropanol
- Spritzen Sie unter der Haut in ungefähr 10-20
Seiten entlang dem Dorn zwischen Schulterblatt und Pelvis mit einer
hypodermatischen Nadel 21G ein. (Anmerkung: Erste
Einspritzung eine Woche nach letztem preimmune Bluten).
- Warten Sie einen Monat und laden Sie mit einer Mischung
des Antigens und der unvollständigen Hilfe auf. Vermeiden Sie
Narben von der vorhergehenden Einspritzung.
- Verlaufen Sie nach einer Woche, um auf Immunantwort zu
überprüfen. Die Erhöhung sollte wiederholt werden, wenn
immune Antwort zu schwach war; jedoch sollte ein anderes
Kaninchen gewählt werden, wenn Kaninchen nicht an allem /LI >
reagierte
Referenzen: Garvey, J.S., Cremer, N.E. U.
Sussdorf, AVW (1977) In: Methoden in der Immunitätsforschung.
Publikation. Benjamin/Cummings Publishing Company.
Lesemasse. pp. 545
OBERSEITE
Siebung des Polyclonal Antikörpers mit ELISA
Probe
ELISA Protokoll für Antikörper-Bildschirm:
Materialien für ELISA:
° Platten - 96 Vertiefung Dynatech Immulon, Typ 2.
(Fischer 17-0221-199).
° PBS, TBS
° PBS + 0.1% Tween 20 oder TBS + 0.1% Tween 20.
°, das Lösung = 2% BSA blockt (Typ V) in PBS.
(fügen Sie 0.02% Azid für längere Lagerung.) hinzu
° Elisa Buffer = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS (Azid
wahlweise freigestellt).
° Enzym gebundener Antikörper = Meerrettichperoxydase 1
° Substrat = ABTS - 100X (von Zymed 00-2001)1
° HRP Buffer: Magnesium des 100mM Na
Zitrats pH 4.2(490 Zitronensäure + Magnesium 720 Na Zitrat
Dihydrat + 50 ml H2O, pH 4.2).
° Wasserstoffperoxid 30% (1000X)
OBERSEITE
ELISA Protokoll für Polyclonal Antikörper
1) ADSORBTION DES ANTIGENS
A) Verdünntes AG zu 10 ug/ml in PBS.
B) Fügen Sie UL 100 der AG Lösung jedem gut hinzu.
c) Lassen Sie O.N bedeckt mit Saranverpackung, an
4°C.
2) BLOCKEN
A) Wäsche-ungebundenes AG, indem es die
Platten umkehrt und die Vertiefungen schlägt, trocknen.
B) Spülen, durch PBS jedem wieder hinzufügen
Vertiefung und es umkehren (Gebrauch sprizt Flasche).
c) Wiederholen Sie das Spülen zweimal.
d) Fügen Sie UL 100 von Lösung gut blocken jedem
hinzu, lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei O.N an 4°C.
3) PRIMÄRANTIKÖRPER
A) Fügen Sie den geprüft zu werden hinzu
Antikörper,:
Sup der Zellen = UL 25, mischen gut, indem er auf und ab
pipeting (10mal).
Serum, Bauchwassersucht = 1:100 und ein serie von 1/5
Verdünnungen. Tun Sie Verdünnungen, wenn Sie Lösung blocken.
B) Lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei
O.N an 4°C.
4) SEKUNDÄRANTIKÖRPER
A) Ungebundener Antikörper der Wäsche
4mal mit PBS + 0.1% Tween 20.
B) Fügen Sie UL 100 des Enzym gebundenen
Antikörpers allen Vertiefungen hinzu. Tun Sie die passenden
Verdünnungen im Elisa Buffer. (ex: HRP ist 2000X).
c) Lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei
O.N an 4°C.
5) SUBSTRAT
A) Disolve Substrat im Wasser.
B) Wäscheplatte 4mal mit PBS + 0.1% Tween 20
(Gebrauch TBS anstelle von PBS für AP).
c) Fügen Sie UL 100 des Substrates jeder Vertiefung
hinzu.
d) Überwachen Sie Farbe Entwicklung. Dieses
konnte von einigen Sekunden zu 20 Minuten nehmen.
e) Wenn Sie benötigt werden, stoppen Sie die
Reaktion, indem Sie UL 50 von 4M NacOh hinzufügen.
f) gelesene Absorption im Elisa Leser an der korrekten
Wellenlänge (für HRP System 416 nm, für AP - 405 nm).
OBERSEITE
Polyclonal Antikörper-Forum-Themen
| Gewinde |
| Gewinde-Name/Plakat | Letzter Pfosten | Antworten | Ansichten |
| | 03-20-2008 05:43 MORGENS | 1 | 278 |
Sie müssen JETZT
REGISTRIEREN , um eine Frage im Antikörper-Forum
bekanntzugeben. LOGON jetzt, wenn Sie bereits registriert
haben.
Antikörper-Produkte U. Dienstleistungen
Andere Antikörper-Web site
Sehen Sie, daß
Antikörper- Station eine neue Site ist, die
Antikörper, Antikörperlieferanten und andere Antikörper-in
Verbindung stehende Informationen umfaßt.
Finden Sie anderen Antikörper und in Verbindung
gestandene Monoclonal Antikörperthemen hier: