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Molekulare Biologie Blog

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Polyclonal Antikörper

Ganz über polyclonal Antikörper.

Polyclonal Antikörper-In Verbindung stehende Externe Betriebsmittel - Protokolle:

• Westlicher Fleck
• Immunoblot
• Immunopräzipitation (IP)
• Kreation der Antikörper mit Peptiden

Auch Besuch Antikörper- Station für mehr auf Polyclonal Antikörpern. Es ist eine neue Site, die Antikörperlieferanten ausdruckt, erlernt über Antikörper und Protokolle.

Polyclonal Antikörperprotokolle:

• Immunisierende Mäuse
• Serum-Vorbereitung vom Blut
• Kaninchen-Immunisierung
• Kaninchen-Blutenprozedur
• Erhalten des Serums
• Ammoniumsulfatniederschlag von IgG vom Serum
• Immunisierung
• ELISA Protokoll für Polyclonal Antikörper-Siebung

Polyclonal Antikörper

 

Polyclonal Antikörper sind die Antikörper, die von vielen B-Zellen oder von B-Zelle Zeilen, ähnlich sind der Mischung der Antikörper berechnet werden, die in den Blutseren gefunden werden.

Polyclonal Antikörper sind folglich eine Mischung vieler unterschiedlicher Antikörperbesonderheiten.

Die gekauften Polyclonal Antikörpervorbereitungen sind Mischungen der Antikörper vieler unterschiedlicher Besonderheiten zum gleichen Antigen.

Immunisierung eines Kaninchens, der Maus, der Ziege, des Huhns oder anderen Tieres produziert polyclonal Antikörper. Tierseren können direkt benutzt werden, gleichwohl es besser ist, polyclonal Antikörper für Laborverbrauch zu reinigen.

Polyclonal Antikörper-Vorbereitung

Gegründet auf dem Protokoll durch Dr. David Bowtell

Immunisierung der Mäuse:

Die Einspritzungen, zum der Mäuse für das Erzeugung der polyclonal Antikörper zu immunisieren sollten in Abständen von mindestens zwei Wochen getrennt gebildet werden.

Die folgenden 2 Hilfen sind erfolgreich gewesen:

• Freund Hilfe und MPL+TDM Hilfe (RIBI ImmunoChem Research, Inc.). Mpl ist weniger gefährlich als die erste Hilfe.

1. Für die erste Immunisierungeinspritzung: spritzen Sie 15 - 50 ug wenn Antigen in der UL 200 Hilfe ein, subkutan eingespritzt.
2. Die zweite Einspritzung sollte später auftreten 2 Wochen; Sie müssen mit 15 - 50 ug des Antigens in der Hilfe dann aufladen. (wenn Zeit ermöglicht, laden Sie wieder ein Monat später auf).
3. Sieben bis 10 verlaufen Tage später das Mäuse- und Testserum mit der Probe, die für Siebung verwendet wird. Wenn Titer nicht stark genug ist, Erhöhung wieder zwei Wochen nach vorhergehender Erhöhung.

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Serum-Vorbereitung:

1. Nachdem man gesammelt hat sollte Blut für 60 Minuten gerinnen lassen werden. an 37°C oder an O.N an 4°C.
2. Trennen Sie den Klumpen von den Seiten des Gefäßes (Klingeln) eine pasteur Pipette verwendend. Plazieren Sie Klumpen an 4°C O.N.
3. Spinnen Sie bei 10000 x g für 10 Min. an 4°C, um das Serum zu trennen.
4. Serum kann an -20°C gespeichert werden, nachdem man Glycerin 50% hinzugefügt hat.

Wenn monoclonal, werden Antikörper gewünscht, sobald Sie ein "gutes" polyclonal und eine zuverlässige Siebmethode zum folgenden Jobstep fortfahren lassen.

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Kaninchen:

Kaninchen werden im Wesentlichen immunisiert, wie oben beschrieben. Einspritzungen:

1. Zuerst Freunds in der kompletten Einspritzung 100-200ug/1ml, zwei Sites (über jeder Schulter).
2. An zweiter Stelle 1 Monat später in Freunds UNVOLLSTÄNDIG als oben.
3. Blutung 2 Wochen später. Erhöhung 2 Wochen später wieder (2 + 2 Woche Schleife).

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PRODUKTION DER POLYCLONAL ANTIKÖRPER IN DEN KANINCHEN (NEUSEELAND WEISS)

Gegründet auf dem Protokoll durch Dr.Walter Steffen.

Die Kaninchen sollten 3-4 Kilogramm Gewicht und in ungefähr 3 im Monaten sein alt. Über einen Third des Kaninchens haben Sie endogene Anti-Keratin Antikörper und immunoactivity für viele zellulare Bestandteile. Dieses hebt den Wert des Nehmens des vor-immunen Serums von jedem möglichem gegebenen Kaninchen hervor.

Buffer und Lösungen:

• Gesättigte Ammoniumsulfatlösung, 2 Millimeter EDTA, pH 8.0
• 50 des AmmoniumMillimeter azetats, pH 8.0
• 70% Äthanol
• Hilfe Freunds (komplett u. unvollständig)
• Phosphat gepuffertes salziges (PBS) (sehen Sie unten)
• Vaseline
• Xylen

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• Holen Sie das Kaninchen von seinem Rahmen und legen Sie es sicher in einen zurückhaltenen Kasten, der das Ohr zugänglich verläßt. Halten Sie die Ruhe des Kaninchens verhältnismäßig. Datenträger Blut bis 50 ml können von der Hauptarterie leicht gesammelt werden, die hinunter die Mitte der dorsalen Oberfläche des Ohrs läuft.
• Rasieren Sie linkes Ohr um linke Ader mit einer frischen Rasierklinge.
• Wischen Sie Ohr mit dem 70% Äthanol oder dem Isopropanol auf.
• Wischen Sie Ohr mit Xylen um Arterie-Ader Schleife auf, um sich zu weiten.
• Halten Sie die Spitze des Ohrs (fest) und des Ansammlung Gefäßes in einer Hand und mit dem freien Handeinsatz eine hypodermatische Nadel 19G in die geweitete Arterie an. Das Blut sollte anfangen, sofort in das Ansammlung Gefäß zu fließen. Für beste Resultate benutzen Sie einen Teil der Arterie mittler entlang dem Ohr.
• Sammeln Sie bis 50 ml Blut. Wenden Sie den Druck an, der am Punkt des Eintrages der Nadel zum Endbluten gerade vorhergehend ist.
• Treffen Sie Vaseline auf Ohr zu, um Xylenentzündung zu beruhigen.
• Setzen Sie Extravaseline auf Schnitt.

Erhalten Des Serums:

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• Strudelgefäß mit dem gesammelten Blut, zum der Oberfläche zu beschichten und des Klumpenzubehörs zum Gefäß zu verhindern.
• Brüten Sie bei oC 37 1 Stunde lang aus.
• Zentrifugieren Sie bei 2.500 g (#7 in einer klinischen Tabelle Oberseite einstellend) für 10 Minuten.
• Löschen Sie Klumpen und spinnen Sie Serum bei 3.000 g für 10 Minuten.
• Serum sollte gespeichert werden eingefroren worden.

Ammonium-Sulfat-Niederschlag von IgG vom Serum (oC 4, durchgeführt im Kühlraum):

Ammoniumsulfatniederschlag ist eine einfache Methode, zum eines ziemlich reinen IgG Bruches zu erreichen.

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• Poolserum von einem Kaninchen
• Gewichtserum
W1 = _____ g
• Wäschegefäße mit Minute. PBS und wiegen wieder.
W2 = _____ g
• Fügen Sie 2/3 Datenträger W2 gesättigtes Ammoniumsulfat, 2 Millimeter EDTA, pH 8.0 hinzu
Anmerkung: fügen Sie sehr langsam, tropfenweise, beim Rühren bei oC 4 oder benutzen Sie peristaltische Pumpe hinzu.
• Rühren Sie sich für 15 Minuten.
• Übertragung auf 40 ml Zentrifugegefäße; Wäschebecher mit 3 Teilen PBS: 2 Teil fügen Ammoniumsulfat und Gefäßen hinzu.
• Drehbeschleunigung bei 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 U/min) für 10 Minuten.
• Verwerfen Sie Supernatant.
• Setzen Sie Tablette in PBS erneut aus [ 1/2 W1 = 1/2 Vol.. ].
• Spinnen Sie bei 12.000 g für 10 Minuten, verwerfen Sie Tablette.
• Sammeln Sie Supernatant im Becher, Wäschewände mit PBS.
Stellen Sie W3 = _____ fest
• Fügen Sie 2/3 Vol. hinzu. W3 gesättigtes Ammoniumsulfat, beim Rühren. Fahren Sie fort, für 15 Minuten sich zu rühren.
• Übertragen Sie Aufhebung auf 40 ml Zentrifugegefäße, Wäschegefäß mit PBS/ammonium Sulfatlösung.
• Spinnen Sie bei 12.000 g für 10 Minuten.
• Verwerfen Sie Supernatant.
• Setzen Sie Tabletten in 1/4 W1 PBS erneut aus.
• Dialysieren Sie gegen PBS, 3-times je 6 Stunden.
• Setzen Sie Serum in ein abgestuftes Gefäß, Spülendialysebeutel gut mit PBS ein.
• Holen Sie bis 1/2 W1 = 1/2 Vol. in PBS.
• Stellen Sie Proteinkonzentration und -aliquote für Speicherung fest. Messen Sie die Absorption bei 280 nm. Die Absorption von 1 mg/ml IgG Lösung ist ungefähr 1.5.

Immunisierung:

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• Lösen Sie ~400-600 g Antigen (~200-300 g pro Einspritzung) in 2.2 ml 50 Millimeter Ammoniumazetat, pH 8.0 oder anderes passender Buffer auf. Konzentration hängt von der Antigenizität des eingespritzt zu werden ab Proteins.
• Die Menge des Antigens benötigt worden, um ein Tier zu immunisieren hängt von ihr Antigenizität und die Methode der Immunisierung ab. Wenn Proteine mit niedriger Antigenizität benutzt werden, ist es nützlich, das Protein mit einer niedrigen Konzentration von SDS (bis 0.2%) zu denaturieren. Nur in hohem Grade gereinigtes Antigen sollte für die Produktion der polyclonal Antikörper benutzt werden. Eine einfache Methode, zum eines reinen Antigens zu erhalten ist durch SDS-PAGE. Proteine können auf ein Blatt der Nitrozellulose übertragen werden, mit Ponceau S befleckt werden, mit einer Rasierklinge auszuschneiden, und als Antigen benutzt werden (suchen Sie nach Standardprotokollen in SDS-PAGE).
• Arbeitn Sie 1.1.ml Freunds komplette Hilfe mit einer hypodermatischen Nadel 20G aus, dann stellen Sie 1.1 ml der Antigenlösung auf. Frieren Sie restliche 1.1 ml für Erhöhung ein.
• Den Spulenkern unbeweglich halten, löschen Sie die Nadel und bringen Sie einen sterilen Absperrhahn 3-way an.
• Mischen Sie das Antigen mit der Hilfe, indem Sie hin und her eine zweite Glasspritze zum Absperrhahn anbringen und einspritzen. (Vorsicht: einige Plastikspritzen konnten mit dem Mineralöl reagieren.)
• Eine komplette Emulsion wird nach ungefähr 20-30 Minute gebildet; angezeigt durch eine ziemlich plötzliche Zunahme der Viskosität der Lösung.

Vorsicht: seien Sie sicher, daß die Montage sicher ist!
• Nach mischender Wartezeit ungefähr 20 Minuten vor Einspritzung zur Steuerung, daß Mischung komplett ist (wenn unvollständig, trennt sich Öl).
• Rasieren Sie zurück vom Kaninchen von Schulterblätter zu Pelvis.
• Säubern Sie zurück mit dem 70% Äthanol oder dem Isopropanol
• Spritzen Sie unter der Haut in ungefähr 10-20 Seiten entlang dem Dorn zwischen Schulterblatt und Pelvis mit einer hypodermatischen Nadel 21G ein. (Anmerkung: Erste Einspritzung eine Woche nach letztem preimmune Bluten).
• Warten Sie einen Monat und laden Sie mit einer Mischung des Antigens und der unvollständigen Hilfe auf. Vermeiden Sie Narben von der vorhergehenden Einspritzung.
• Verlaufen Sie nach einer Woche, um auf Immunantwort zu überprüfen. Die Erhöhung sollte wiederholt werden, wenn immune Antwort zu schwach war; jedoch sollte ein anderes Kaninchen gewählt werden, wenn Kaninchen nicht an allem /LI > reagierte

Referenzen: Garvey, J.S., Cremer, N.E. U. Sussdorf, AVW (1977) In: Methoden in der Immunitätsforschung. Publikation. Benjamin/Cummings Publishing Company. Lesemasse. pp. 545

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Siebung des Polyclonal Antikörpers mit ELISA Probe

ELISA Protokoll für Antikörper-Bildschirm:

Materialien für ELISA:

° Platten - 96 Vertiefung Dynatech Immulon, Typ 2. (Fischer 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% Tween 20 oder TBS + 0.1% Tween 20.

°, das Lösung = 2% BSA blockt (Typ V) in PBS. (fügen Sie 0.02% Azid für längere Lagerung.) hinzu

° Elisa Buffer = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS (Azid wahlweise freigestellt).

° Enzym gebundener Antikörper = Meerrettichperoxydase 1

° Substrat = ABTS - 100X (von Zymed 00-2001)1

° HRP Buffer: Magnesium des 100mM Na Zitrats pH 4.2(490 Zitronensäure + Magnesium 720 Na Zitrat

Dihydrat + 50 ml H2O, pH 4.2).

° Wasserstoffperoxid 30% (1000X)

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ELISA Protokoll für Polyclonal Antikörper

1) ADSORBTION DES ANTIGENS

A) Verdünntes AG zu 10 ug/ml in PBS.

B) Fügen Sie UL 100 der AG Lösung jedem gut hinzu.

c) Lassen Sie O.N bedeckt mit Saranverpackung, an 4°C.

2) BLOCKEN

A) Wäsche-ungebundenes AG, indem es die Platten umkehrt und die Vertiefungen schlägt, trocknen.

B) Spülen, durch PBS jedem wieder hinzufügen Vertiefung und es umkehren (Gebrauch sprizt Flasche).

c) Wiederholen Sie das Spülen zweimal.

d) Fügen Sie UL 100 von Lösung gut blocken jedem hinzu, lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei O.N an 4°C.

3) PRIMÄRANTIKÖRPER

A) Fügen Sie den geprüft zu werden hinzu Antikörper,:

Sup der Zellen = UL 25, mischen gut, indem er auf und ab pipeting (10mal).

Serum, Bauchwassersucht = 1:100 und ein serie von 1/5 Verdünnungen. Tun Sie Verdünnungen, wenn Sie Lösung blocken.

B) Lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei O.N an 4°C.

4) SEKUNDÄRANTIKÖRPER

A) Ungebundener Antikörper der Wäsche 4mal mit PBS + 0.1% Tween 20.

B) Fügen Sie UL 100 des Enzym gebundenen Antikörpers allen Vertiefungen hinzu. Tun Sie die passenden Verdünnungen im Elisa Buffer. (ex: HRP ist 2000X).

c) Lassen Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei O.N an 4°C.

5) SUBSTRAT

A) Disolve Substrat im Wasser.

B) Wäscheplatte 4mal mit PBS + 0.1% Tween 20 (Gebrauch TBS anstelle von PBS für AP).

c) Fügen Sie UL 100 des Substrates jeder Vertiefung hinzu.

d) Überwachen Sie Farbe Entwicklung. Dieses konnte von einigen Sekunden zu 20 Minuten nehmen.

e) Wenn Sie benötigt werden, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie UL 50 von 4M NacOh hinzufügen.

f) gelesene Absorption im Elisa Leser an der korrekten Wellenlänge (für HRP System 416 nm, für AP - 405 nm).

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Andere Antikörper-Web site

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