Polyclonal Antikörper

Ganz über polyclonal Antikörper.

Polyclonal Antikörper-in Verbindung stehende externe Betriebsmittel - Protokolle:

• Westlicher Fleck
• Immunoblot
• Immunopräzipitation (IP)
• Kreation der Antikörper unter Verwendung der Peptide

Auch Besuch Antikörper-Station für mehr auf Polyclonal Antikörpern. Es ist eine neue Site, die Antikörperlieferanten ausdruckt, erlernt über Antikörper und Protokolle.

Polyclonal Antikörperprotokolle:

• Immunisierenmäuse
• Serum-Zubereitung aus Blut
• Kaninchen-Immunisierung
• Kaninchen-Blutenprozedur
• Erhalten des Serums
• Ammoniumsulfatniederschlag von IgG vom Serum
• Immunisierung
• ELISA Protokoll für Polyclonal Antikörper-Siebung

Polyclonal Antikörper

Polyclonal Antikörper sind die Antikörper, die von vielen B-Zellen oder von B-Zelle Zeilen, ähnlich sind der Mischung der Antikörper berechnet werden, die in den Blutseren gefunden werden.

Polyclonal Antikörper sind folglich eine Mischung vieler verschiedenen Antikörperbesonderheiten.

Die Polyclonal gekauften Antikörpervorbereitungen sind Mischungen der Antikörper vieler verschiedenen Besonderheiten zum gleichen Antigen.

Immunisierung eines Kaninchens, der Maus, der Ziege, des Huhns oder anderen Tieres produziert polyclonal Antikörper. Tierseren können direkt benutzt werden, gleichwohl es besser ist, polyclonal Antikörper für Laborverbrauch zu reinigen.

Polyclonal Antikörper-Vorbereitung

Gegründet auf dem Protokoll durch Dr. David Bowtell

Immunisierung der Mäuse:

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Serum-Vorbereitung:

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Kaninchen:

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PRODUKTION DER POLYCLONAL ANTIKÖRPER IN DEN KANINCHEN (NEUSEELAND WEISS)

Gegründet auf dem Protokoll durch Dr.Walter Steffen.

Die Kaninchen sollten 3-4 Kilogramm im Gewicht und in ungefähr 3 Monate alten sein. Über ein Drittel des Kaninchens haben Sie endogene Anti-keratin Antikörper und immunoactivity für viele zellulare Bestandteile. Dieses hebt den Wert des Nehmens des vor-immunen Serums von jedem möglichem gegebenen Kaninchen hervor.

Buffer und Lösungen:

• Gesättigte Ammoniumsulfatlösung, 2 Millimeter-EDTA, pH 8.0
• 50 des Ammoniummillimeter Azetats, pH 8.0
• 70% Äthanol
• Freunds Hilfe (komplett u. unvollständig)
• Phosphatgepuffertes salziges (PBS) (sehen Sie unten)
• Vaseline
• Xylen

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• Holen Sie das Kaninchen von seinem Rahmen und legen Sie es sicher in einen zurückhaltenen Kasten, der das Ohr zugänglich verlässt. Halten Sie die Ruhe des Kaninchens verhältnismäßig. Datenträger Blut bis 50 ml können von der Hauptarterie leicht gesammelt werden, die hinunter die Mitte der dorsalen Oberfläche des Ohrs läuft.
• Rasieren Sie linkes Ohr um linke Ader mit einer frischen Rasierklinge.
• Wischen Sie Ohr mit dem 70% Äthanol oder dem Isopropanol auf.
• Wischen Sie Ohr mit Xylen um Arterieader Schleife auf, um sich zu weiten.
• Halten Sie die Spitze des Ohrs (fest) und des Ansammlungsgefäßes in einer Hand und mit dem Handlungsfreiheiteinsatz eine hypodermatische Nadel 19G in die geweitete Arterie an. Das Blut sollte anfangen, sofort in das Ansammlungsgefäß zu fließen. Für beste Resultate benutzen Sie einen Teil der Arterie mittler entlang dem Ohr.
• Sammeln Sie bis 50 ml Blut. Wenden Sie den Druck an, der an der Eingangsstelle der Nadel, um zu verlaufen zu stoppen gerade vorhergehend ist.
• Treffen Sie Vaseline auf Ohr zu, um Xylenentzündung zu beruhigen.
• Setzen Sie Extravaseline auf Schnitt.

Erhalten des Serums:

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• Strudelgefäß mit dem gesammelten Blut, zum der Oberfläche zu beschichten und des Klumpenzubehörs zum Gefäß zu verhindern.
• Brüten Sie bei 37 Oc 1 Stunde lang aus.
• Zentrifugieren Sie bei 2.500 g (Einstellung #7 in einer klinischen Tabellenoberseite) für 10 Min.
• Löschen Sie Klumpen und spinnen Sie Serum bei 3.000 g für 10 Min.
• Serum sollte gespeichert werden eingefroren worden.

Ammonium-Sulfat-Niederschlag von IgG vom Serum (4 Oc, durchgeführt im Kühlraum):

Ammoniumsulfatniederschlag ist eine einfache Methode, zum eines ziemlich reinen IgG Bruches zu erreichen.

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• Poolserum von einem Kaninchen
• Gewichtserum
W1 = ___ g
• Waschen Sie Gefäße mit min. PBS und wiegen Sie wieder.
W2 = ___ g
• Fügen Sie 2/3 Datenträger W2 gesättigtes Ammoniumsulfat, 2 Millimeter-EDTA, pH 8.0 hinzu
Anmerkung: fügen Sie sehr langsam, tropfenweise, beim Rühren bei 4 Oc oder benutzen Sie peristaltische Pumpe hinzu.
• Rühren Sie sich für 15 Min.
• Übertragung auf 40 ml-Zentrifugegefäße; Wäschebecher mit 3 Teilen PBS: 2 Teil fügen Ammoniumsulfat und Gefäßen hinzu.
• Drehbeschleunigung bei 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 U/min) für 10 Min.
• Verwerfen Sie Supernatant.
• Setzen Sie Tablette in PBS erneut aus [1/2 W1 = 1/2 Vol.].
• Spinnen Sie bei 12.000 g für Minute 10, verwerfen Sie Tablette.
• Sammeln Sie Supernatant im Becher, Wäschewände mit PBS.
Stellen Sie W3 = ___ fest
• Fügen Sie 2/3 Vol.-W3 gesättigtes Ammoniumsulfat, beim Rühren hinzu. Setzen Sie Stirring für 15 Min. fort.
• Übertragen Sie Aufhebung auf 40 ml-Zentrifugegefäße, Wäschegefäß mit PBS/ammonium Sulfatlösung.
• Spinnen Sie bei 12.000 g für 10 Min.
• Verwerfen Sie Supernatant.
• Setzen Sie Tabletten in 1/4 W1 PBS erneut aus.
• Dialysieren Sie gegen PBS, 3 mal je 6 Stunden.
• Setzen Sie Serum in ein abgestuftes Gefäß, Spülendialysebeutel gut mit PBS ein.
• Holen Sie bis 1/2 W1 = 1/2 Vol. in PBS.
• Stellen Sie Proteinkonzentration und -aliquote für Speicherung fest. Messen Sie die Absorption bei 280 Nanometer. Die Absorption von 1 mg/ml IgG Lösung ist ungefähr 1.5.

Immunisierung:

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• Lösen Sie ~400-600 g das Antigen (~200-300 g pro Einspritzung) in 2.2 ml 50 Millimeter Ammoniumazetat, Buffer pH-8.0 oder anderes passender auf. Konzentration hängt von der Antigenizität des eingespritzt zu werden ab Proteins.
• Die Menge des Antigens benötigt worden, um ein Tier zu immunisieren hängt von ihr Antigenizität und die Methode der Immunisierung ab. Wenn Proteine mit niedriger Antigenizität benutzt werden, ist es nützlich, das Protein mit einer niedrigen Konzentration von SDS (bis 0.2%) zu denaturieren. Nur in hohem Grade gereinigtes Antigen sollte für die Produktion der polyclonal Antikörper benutzt werden. Eine einfache Methode, zum eines reinen Antigens zu erhalten ist durch SDS-PAGE. Proteine können auf ein Blatt der Nitrozellulose übertragen werden, mit Ponceau S befleckt werden, mit einer Rasierklinge herausgeschnitten werden, und als Antigen benutzt werden (suchen Sie nach Standardprotokollen in SDS-PAGE).
• Arbeiten Sie 1.1.ml Freunds komplette Hilfe mit einer hypodermatischen Nadel 20G aus, dann stellen Sie 1.1 ml der Antigenlösung auf. Frieren Sie restliche 1.1 ml für Erhöhung ein.
• Den Spulenkern unbeweglich halten, löschen Sie die Nadel und bringen Sie einen sterilen Dreiwegeabsperrhahn an.
• Mischen Sie das Antigen mit der Hilfe, indem Sie hin und her eine zweite Glasspritze zum Absperrhahn anbringen und einspritzen. (Vorsicht: einige Plastikspritzen konnten mit dem Mineralöl reagieren.)
• Eine komplette Emulsion wird nach Minute ungefähr 20-30 gebildet; angezeigt durch eine ziemlich plötzliche Zunahme der Viskosität der Lösung.

Vorsicht: seien Sie sicher, dass die Montage sicher ist!
• Nach mischender Minute ungefähr 20 der Wartezeit vor zu steuern der Einspritzung, dass Mischung komplett ist (wenn unvollständig, trennt sich Öl).
• Rasieren Sie zurück vom Kaninchen von Schulterblätter zu Pelvis.
• Säubern Sie zurück mit dem 70% Äthanol oder dem Isopropanol
• Spritzen Sie unter der Haut in ungefähr 10-20 Seiten entlang dem Dorn zwischen Schulterblatt und Pelvis unter Verwendung einer hypodermatischen Nadel 21G ein. (Anmerkung: Erste Einspritzung eine Woche nach letztem preimmune Bluten).
• Warten Sie einen Monat und laden Sie mit einer Mischung des Antigens und der unvollständigen Hilfe auf. Vermeiden Sie Narben von der vorhergehenden Einspritzung.
• Verlaufen Sie nach einer Woche, um auf Immunantwort zu überprüfen. Die Erhöhung sollte wiederholt werden, wenn immune Antwort zu schwach war; jedoch sollte ein anderes Kaninchen gewählt werden, wenn Kaninchen nicht überhaupt reagierte. /LI >

Referenzen: Garvey, J.S., Cremer, N.O. u. Sussdorf, AVW. (1977) In: Methoden in der Immunitätsforschung. Pub. Benjamin/Cummings Publishing Company. Lesemass. pp. 545

Siebung des Polyclonal Antikörpers unter Verwendung der ELISA Probe

ELISA Protokoll für Antikörper-Bildschirm:

Materialien für ELISA:

° Platten - 96 Vertiefung Dynatech Immulon, Typ - 2. (Fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% Tween 20 oder TBS + 0.1% Tween 20.

°, das Lösung = 2% BSA blockt (Typ V) in PBS. (Fügen Sie 0.02% Azid für längere Lagerung.) hinzu

° Elisa Buffer = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS (Azid wahlweise freigestellt).

° Enzym gebundener Antikörper = Meerrettichperoxydase 1

° Substrat = ABTS - 100X (von Zymed 00-2001) 1

° HRP Buffer: 100mM Na-Zitrat pH 4.2 (Zitronensäure mg-490 + mg 720 Na-Zitrat

Dihydrat + 50 ml H2O, pH 4.2).

° Wasserstoffperoxid 30% (1000X)

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ELISA Protokoll für Polyclonal Antikörper

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