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Agarose-Gel-Elektrophorese

Diese Site der Agarose-Gel-Elektrophorese ist Ihr Portal für alle Sachen, die auf der Agarosegel-Elektrophoresetechnik und seiner Analyse in Verbindung gestanden werden. Wir versehen Sie mit allen Hintergrundinformationen, Protokollen, Analyse Jobsteps, Sichtbarmachung und Fehlersuchinformationen für laufende Agarosegele für DNA, RNS oder Protein, um der entscheidende Experte in der Agarosegelelektrophorese zu werden!

Agarose-Gel-Elektrophorese-Inhaltsverzeichnis

• Was ist Agarose-Gel-Elektrophorese?
• Hintergrund
• Anwendungen
• Materialien
• Buffer
• Migration
• Behebende Begrenzungen auf Agarose-Gele
  
• Vorbereitung
• Protokoll
• Sichtbarmachung
• Gel-Analyse
• Agarose-Gel-Elektrophorese Videos
• Andere Agarose-Gel-Elektrophorese-Protokolle
• Fehlersuchagarose-Gele
• Diskussion Themen für Agarose-Gel-Elektrophorese
• Erhalten Sie Hilfe auf Ihrem Agarose-Gel-Problem

Was ist Agarose-Gel-Elektrophorese?

Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, die in der Biochemie und in der molekularen Biologie verwendet wird, um DNA zu trennen, oder RNS- Moleküle durch Größe jedoch Proteine können auf Agarosegelen auch getrennt werden. Trennung der Moleküle wird erzielt, indem man negativ belastete Nukleinsäuremoleküle durch eine Agarosematrix in einem elektrischen verschiebt, auffangen (sehen Sie Elektrophorese). Kürzere Moleküle bewegen schneller und ziehen weiter als länger eine fort.

 

 

Anwendungen von Agarose-Gel-Elektrophorese

Agarosegelelektrophorese wird hauptsächlich in der Analyse oder in der Trennung DNA und RNS-DER Moleküle verwendet (obgleich Proteine auf Agarosegelen auch getrennt werden können), gleichwohl Trennung auch die Reinigung der spezifischen Größen von DNAs nach Beschränkung Enzymverdauung erlaubt. Dieses wird normalerweise beim Klonen verwendet, zum der Schnittplasmide zu erreichen, in denen Agarosegelelektrophorese Schnittvektoren von den ungeschnittenen trennt.

So gewähren Agarosegele:

1. Trennung des Beschränkung Enzyms verdaute DNA einschließlich genomic DNA, vor südlicher Fleckübertragung. Sie wird auch häufig für das Trennen von von RNS vor Nordübertragung verwendet.
2. Analyse der PCR Produkte nach für Ziel DNA Verstärkung festzusetzen der Polymerasekettenreaktion.
3. Läßt die Schätzung der Größe der DNA Moleküle mit einer DNA Markierung oder einer Strichleiter zu, die DNA Fragmente der verschiedenen bekannten Größen enthält.
4. Erlaubt die rauhe Schätzung der DNA Quantität und der Qualität.
5. Quantität wird mit Lambda DNA Strichleiter festgesetzt, die spezifische Mengen DNA in den unterschiedlichen Bändern enthält.
6. Qualität von DNA wird festgesetzt, indem man das Fehlen Streifen oder Fragmenten beobachtet (oder Verschmutzen der DNA Bänder).
7. Andere Techniken beruhen auf Agarosegelelektrophorese für DNA Trennung einschließlich DNA Fingerabdruck.

Vorteile und Nachteile von Agarose gelatieren Elektrophorese

Die Vorteile sind, daß das Gel leicht gegossen wird, denaturiert nicht die Proben. Die Proben können auch wieder hergestellt werden.

Die Nachteile sind, daß Gele während der Elektrophorese schmelzen können, der Buffer können erschöpft werden, und unterschiedliche Formulare des genetischen Materials können in unvorhersehbare Formen laufen.

Migration in den Agarose-Gelen

Der wichtigste Faktor ist die Länge des DNA Moleküls, kleinere Moleküle reisen weit. Aber Anpassung des DNA Moleküls ist auch ein Faktor. Um lineare Moleküle dieses Problems zu vermeiden werden normalerweise getrennt, normalerweise DNA Fragmente von einer Beschränkung Auswahl, lineare DNA PCR Produkte oder RNAs.

Die Erhöhung der Agarosekonzentration eines Gels verringert die Migration Geschwindigkeit und aktiviert Trennung der kleineren DNA Moleküle. Das höher die Spannung, schneller zieht die DNA fort. Aber Spannung wird durch die Tatsache begrenzt, daß sie erhitzt und schließlich das Gel veranläßt zu schmelzen. Hohe Spannungen verringern auch die Zerlegung (über ungefähr 5 bis 8 V/cm).[citation benötigt ]

Conformations eines DNA Plasmids, das nicht mit einem Beschränkung Enzym geschnitten worden ist, bewegt mit den unterschiedlichen Geschwindigkeiten (am langsamsten zu am schnellsten): eingekerbt oder öffnen Sie Rundschreiben, linearised oder supercoiled Plasmid.

Behebende Begrenzungen auf Agarose-Gele

Agarosegele können für die Trennung der DNA Fragmente, die von 50 niedrigen Paaren bis zu einigen megabases (Millionen Unterseiten) reichen durch Elektrophorese benutzt werden. Häufiger jedoch, wird Agarosegelelektrophorese verwendet, um DNA von PCR zu trennen und Klonen in der Strecke 100bp ungefähr zu den Abläufen 15kb. sind ungefähr 30 Minuten - 1 Stunde lang.

Kleines DNAs oder RNAs (kleiner als 100bp) werden besser durch Polyacrylamidgele getrennt, gleichwohl 2-3% Agarosegele ausreichend sein können, gleichmäßige Fragmente 50bp von den viel größeren Nukleinsäuren zu trennen.

Vor kurzem jedoch, ist es gezeigt worden, daß bis ein niedriger Paargröße Unterschied auf einem 3% Agarosegel mit einem extrem niedrigen Leitfähigkeitmedium wie 1 des LithiumMillimeter salzen (Brody JR, Calhoun ES, Gallmeier E, Creavalle TD, Kern SE (2004) behoben werden könnte. Ultraschnelle hochauflösende Agaroseelektrophorese von DNA und von RNS mit niedrigen-molarity leitenden Media. Biotechniques. 37:598-602.).

 

Tabelle des Agarose-Gel-Prozentsatzes und der leistungsfähigen Strecke der Trennung:

Wie Sie sehen können, daß niedrige Prozentsatzagarosegele für die Trennung der großen DNA Moleküle am besten sind, während hoch, sind Prozentsatzgele für kleineres DNAs am besten.

 

DNA Reinigung mit Agarose-Gel-Extraktion

Wie vor erwähnt, erlaubt Agarosegelelektrophorese die Trennung und folglich die Reinigung von DNA für Klonen. Jedoch benötigt dieses normalerweise niedrige agarose des hohen Reinheitsgrades Schmelz,wenn die DNA vom Gel extrahiert werden soll.

Agarose-Gel-Elektrophorese-Buffer

Abhängig von der Größe der DNA electrophoresed und die Anwendung, unterschiedliche Buffer kann für Agaroseelektrophorese verwendet werden. TAE Buffer (oder Tris Azetat EDTA) ist der geläufigste benutzte Agarosegel-Elektrophoresebuffer. TAE hat die niedrigste Dämpfungsfähigkeit der Buffer, gleichwohl TAE die beste Zerlegung für größere DNA anbietet. Jedoch benötigt TAE eine Niederspannung und mehr Zeit.

Jedoch wird TBE Buffer (Tris/Borate/EDTA) häufig für kleinere DNA Fragmente benutzt (IE kleiner als 500bp).

 

Natriumtetraborat oder SB-Buffer ist ein neuer Buffer, gleichwohl er für behebende Fragmente größer als 5 KBS erfolglos ist. Jedoch hat SB Vorteile in seiner niedrigen Leitfähigkeit und erlaubt höhere Spannungen (bis 35 V/cm). Dieses konnte eine kürzere Analyse Zeit für Routineelektrophorese gewähren.