Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

RNA Protocols RNA protokoller

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Nyheder

RNA Isolation RNA Isolation

RNA Extraction Background Information RNA Udvinding Background Information

Obtaining high quality, intact RNA is the first and often the most critical step in performing many fundamental molecular biology experiments, including Northern analysis, nuclease protection assays, RT-PCR, RNA mapping, in vitro translation and cDNA library construction. Opnåelse af høj kvalitet, intakt RNA er den første og ofte de mest kritiske trin i udførelsen af mange grundlæggende molekylær biologi eksperimenter, herunder det nordlige analyse, nuclease beskyttelse assays, RT-PCR, RNA kortlægning, in vitro-oversættelse og cDNA bibliotek opbygning. To be successful, however, the RNA isolation procedure should include some important steps both before and after the actual RNA purification. Forudsætningen for succes er imidlertid, RNA isolation procedure bør omfatte nogle vigtige skridt, både før og efter den faktiske RNA rensning.

Basic RNA Isolation Methods Grundlæggende RNA Isolation Methods

Depending on the RNA to be extracted, there are properties of RNA that allow it to be isolated away from other cellular materials such as proteins, DNA and even lipids. Afhængig af RNA, der skal udvindes, der er egenskaber ved RNA, som gør det muligt at isolere det væk fra andre cellulære materialer såsom proteiner, DNA og endda lipider.

Messenger RNA or mRNA contains a stretch adenosine residues in the form of a poly(A) tail. Messenger RNA eller mRNA indeholder en strækning adenosin restprodukter i form af en poly (A) hale. This has been exploited to allow mRNA to be bound to poly(T) affinity columns or beads. Dette er blevet udnyttet til at tillade mRNA at være bundet til poly (T) affinitet kolonner eller perler.

Tips for RNA Extraction and Isolation Tips til RNA Udvinding og isolation

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Hvis du i øjeblikket har en foretrukket metode til isolering af RNA, fortsætte med at bruge det.

If you haven't isolated RNA from your system before and your organism is not on the following list, we can help you identify established protocols that have been used for isolating RNA for Northern blotting or RT-PCR from your system. Hvis du ikke har isoleret RNA fra dit system før og din organisme ikke er på nedenstående liste, kan vi hjælpe dig med at identificere etableret protokoller, der er blevet anvendt til isolering af RNA for Northern blotting eller RT-PCR fra dit system. These types of protocols will also yield "microarray-grade" RNA. Disse typer af protokoller vil også give "microarray-grade"-RNA.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Altid køre en agarosegel af dine RNA til at vurdere kvaliteten.

NOTE: If you use a non column based purification reagent such as TRIzol we recommend you precipitate your RNA a second time from ethanol or you pass it through an Rneasy column or similar device. BEMÆRK: Hvis du bruger en ikke kolonne baseret rensning reagens såsom TRIzol anbefaler vi, at du bundfald din RNA et andet tidspunkt end ethanol eller du passerer den gennem en Rneasy kolonne eller lignende enhed. This insures removal of all organic contaminants (See spectra below). Dette sikrer fjernelse af alle organiske forurenende stoffer (Se spektre nedenfor).

RNase Inhibitors Used in RNA Extraction and Isolation RNase hæmmere Bruges i RNA Udvinding og isolation

Checking RNA Isolation Quality and Quantity Tjek RNA Dyrkning kvalitet og kvantitet

Efficient nuclear/cytoplasmic fractionation can be quickly assessed by denaturing agarose gel analysis (see Figure 1). Effektive nukleare / cytoplasmic fraktionering hurtigt kan vurderes ved denaturering agarosegel analyse (se figur 1). Bands correspond-ing to precursor rRNA should be equivalent in the total and nuclear RNA fraction. Bands svare-Ing at forløber rRNA bør være tilsvarende i det samlede og nukleare RNA-fraktion. The 18S and 28S rRNA bands will be less intense in the nuclear RNA fraction than in either total RNA or cytoplasmic fraction RNA. De 18s og 28S rRNA bands vil blive mindre intens i den nukleare RNA-fraktion end i enten total RNA eller cytoplasmic brøkdel RNA. In some cell lines, for example 293 and COS-7 cells, this difference will be dramatic, but in other cells lines such as HeLa cells, the rRNA bands are only slightly less intense in nuclear RNA than in total or cytoplasmic fraction RNA." I nogle cellelinjer, for eksempel 293 og COS-7 celler, denne forskel vil blive dramatisk, men i andre celler linjer såsom hela celler, rRNA bands er kun en anelse mindre intens med nukleare RNA end i alt eller cytoplasmic brøkdel RNA. "

RNA Purity RNA Renhed

A260 readings and 260/280 ratios are not enough to ensure high purity RNA. A260 behandlinger og 260/280 nøgletal er ikke nok til at sikre en høj renhed RNA. You must take a full UV spectrum. Du skal tage en fuld UV-spektrum. Below are 3 example spectra which all have good 260/280 ratios, but have very different purities. Nedenfor er 3 eksempel spektre, som alle har gode 260/280 nøgletal, men har meget forskellige purities. You can also use the 260/230 ratio to help determine the amount of organic contamination in your RNA. Du kan også bruge 260/230 ratio for at bestemme mængden af organisk forurening i din RNA. It is a much more variable number than the 260/280 ratio, but generally, ratios above 1 indicate good purity. Det er et langt mere variabelt antal end 260/280 ratio, men generelt nøgletal over 1 indikerer god renhed.

Quantifying RNA Extraction and Isolation Kvantificere RNA Udvinding og isolation

RNA Isolation from Subcellular Fractions RNA Isolering fra Subcellular Brøker

Cells were then washed in PBS and successively extracted as described. Celler blev derefter vasket i PBS og successivt udvindes som beskrevet. First, cells were extracted with the Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Først og celler blev hentet med Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheder / ml Rnasin, 1 mM DTT). The remaining pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) and nucleus) was washed in the same buffer and extracted in buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 mM EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De resterende pillen (uslebne endoplasmic reticulum (RER) og nucleus) blev vasket i samme buffer og udvindes i buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0,5% (v / v) Nonidet P-40 , 40 mM EDTA, 40 enheder / ml Rnasin, 1 mM DTT). The remaining nuclear pellet was washed in the same buffer and extracted with high salt buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De resterende nukleare pillen blev vasket i samme buffer og ekstraheres med et højt salt-buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0,5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheder / ml Rnasin, 1 mM DTT). RNA was purified from each fraction by the RNA STAT solution. RNA blev oprenset fra hver fraktion af RNA-STAT løsning. Total RNA was isolated using the RNA-STAT60 reagent (Tel-test) according to the instructions provided by the manufacturer. Total RNA blev isoleret ved hjælp af RNA-STAT60 reagens (Tel-test) efter instrukser fra fabrikanten. (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002) (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

RNA Isolation Using CsCl Protocol RNA Dyrkning Brug CsCl protokol

Chaos Buffer for RNA isolation Chaos Buffer for RNA isolation

For 100 mls 200 mls For 100 ml 200 ml

4. 5M Guanidinium thiocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls 5M guanidinium thiocyanat 53,2 g 106,4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mm EDTA 0.5M 10 ml 20 ml 25mm Tris-HCl, pH 7,5 1M 2,5 ml 5 ml

0. 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul

5. 7 M CsCl cushion* Final Volume 100 ml 7 M CsCl pude * Sidste bind 100 ml

5. 7 M "Baked" CsCl 95.8g 7 M "Bagt" CsCl 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls 1M EDTA 0.5M 20 ml

RNA Extraction Procedure Using CsCl RNA Ekstraktion med anvendelse af CsCl

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Brug DEPC behandlet vand og bages glasvarer. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Denne løsning, absolut positivt skal Rnase fri. Rnase is everywhere! Rnase findes overalt! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Brug handsker, brug kun bagt glasvarer, eller jomfru plast. DePC treat your water, buffers (except Tris). DEPC behandle din vand, buffere (undtagen Tris). Be very careful. Vær meget forsigtig.

1. Weigh animal. Afvej dyr. Remove organ (liver), weight One of the superior attributes of cDNA is you reduce the gene complexity by choosing an organ that only expresses a single locus of a multilocus enzyme. Fjern organtransplantation (lever), vægt Et af de fineste attributter CDNA er du reducerer gen kompleksitet ved at vælge et organ, som kun udtrykker en enkelt placering af en multilocus enzym. 2 . 2. Homogenize tissue rapidly in "Chaos" buffer (9mls) 3 . Homogeniseres væv hurtigt i "Chaos" buffer (9mls) 3. Spin homogenant at 12 KG to remove insoluble material 4 . Spin homogenant på 12 kg for at fjerne uopløselige materiale 4. WHILE Homogenant IS SPINNING 4A. MENS Homogenant ER SPINDING 4A. Weight out 1.8 g of CsCl (0.2g/ml) per sample. Vægt, 1,8 g CsCl (0.2g/ml) pr prøve. 4B. In the ultra-centrifuge tube ("quick-seal") add 3.5mls of 5.7M CsCl "cushion" This layer must be Rnase free. I de ultra-centrifugeglas ( "quick-segl") tilføjer 3.5mls af 5.7M CsCl "stødpude" Dette lag skal Rnase fri. You will centrifuge your RNA through this layer and any contamination will cause significant losses. Du vil centrifuge din RNA gennem dette lag og enhver forurening vil medføre betydelige tab. 5 . 5. Remove supernant, put into fresh tube, add 1.8 g CsCl 6 . Fjern supernant, taget i frisk tube, tilsættes 1,8 g CsCl 6. Carefully, add homogenant on top of the CsCl cushion. Omhyggeligt, tilføje homogenant på toppen af CsCl pude. This is most readily accomplished by using a 10cc syringe and long needle. Dette er meget let ved hjælp af en 10cc sprøjte og lang nål. Place needle/syringe into quick-seal tube, and add tissue homogenant to the syringe. Sted kanyle / sprøjte i quick-segl røret, og tilføj væv homogenant til sprøjten. Homogenant will slowly trickle into QS tube, floating on top of the cushion. Homogenant vil langsomt sive ind i QS røret, flyder på toppen af pude.

7. Carefully, balance matched pairs of centrifuge tube (+/-0.005 g). Omhyggeligt, balance matchede par centrifugeglas (+ / -0,005 g).

8. Seal tubes, place matched tubes opposite of each other and cap with red aluminum tops. Seal rør, sted matchede rør modsatte af hinanden og cap med røde aluminium toppe.

9. Centrifuge, 50,000 rpms 5.5 hrs, 20oC Centrifuger, 50.000 rpms 5,5 t., 20 oC

After centrifugation: Mark tubes where pellet should be: on the bottom outer side (relative to center of rotor) Efter centrifugering: Mark rør, hvor pillen bør være: på den nederste udvendige side (i forhold til midten af rotoren)

10. Remove tubes, place in convenient rack. Fjern rør, sted i bekvem rack.

11. Slice off the top of tube.Aspirate off the top 2/3- 3/4 of solution. Skive off toppen af tube.Aspirate off toppen 2/3- 3 / 4 af løsningen. WORK FROM THE TOP DOWN. Arbejde fra toppen og ned. IT IS IMPORTANT THAT YOU ASPIRATE OFF THE UPPER MOST SOLUTION FIRST AND REMOVE ALL BUT THE CLEAR CUSHION. Det er vigtigt at du Aspirér OFF de øverste LØSNING FØRSTE OG fjerne alle MEN DET FREMGAAR CUSHION. DO NOT ASPIRATE THE INVISIBLE PELLET AT THE BOTTOM. IKKE Aspirér den usynlige pillen i bunden.

12. Cut off the top 2/3 of tube. Klip toppen 2 / 3 af glasset. Using a "pulled" Pasteur pipet, carefully remove remaining solution. Brug en "trukket" Pasteur-pipette, omhyggeligt fjerne de resterende løsning. The pellet will be on the bottom-side of the tube. Pillen vil være på nederste side af glasset.

13. Rinse pellet with 70% EtOH, remove (use Pasteur pipets), repeat twice (total 3 washes) Rinse pillen med 70% EtOH, fjerne (brug Pasteur pipets), gentages to gange (i alt 3 gange vask)

14. Add 200 ul of 0.1x TE (RNase free), using the pipet tip to crush pellet and "titrating" TE attempt to put pellet into solution. Tilsæt 200 ul af 0.1x TE (RNase gratis) med anvendelse af pipette tip at knuse pillen og "titreres" TE forsøg på at lægge pillen i opløsning. At least form a heterogeneous solution and put into a fresh microfuge tube. Mindst udgør en heterogen løsning og lagt i en frisk mikrofugeglas rør.

15. Repeat with 200 ul of TE pooling both solutions Gentag med 200 ul af TE samle begge løsninger

16. Vortex, good RNA does not like to go into solution. Vortex, god RNA ikke kan lide at gå i opløsning. Patience is a virtue. Tålmodighed er en dyd.

17. Determine concentration, 10 ul into 490 ul (500 ul final vol) Bestem koncentrationen, 10 ul i 490 ul (500 ul endelig vol.)

18. Remove 1 to 2 ug of RNA for gel analysis (add RNA loading buffers) Fjern 1 til 2 ug af RNA for gel analyse (tilføj RNA lastning buffere)

19. Add 1/10 volume Rnase free 3M NaOAC (40 ul), 2.5 volumes of EtOH (1.0ml). Tilsæt 1 / 10 volumen Rnase fri 3M NaOAC (40 ul), 2,5 mængder af EtOH (1.0ml). Mix vigorously. Bland kraftigt.

20. You can calculate the concentration of RNA in the EtOH.Thus, there is no need to precipitate all of your RNA at once. Du kan beregne koncentrationen af RNA i EtOH.Thus, er der ingen grund til at udfældes alle dine RNA på en gang. Just remove about 1.5 to 2 times the amount you need by vortexing EtOH/RNA solution and remove the appropriate volume. Bare fjerne ca 1,5 til 2 gange det beløb, du har brug med en vortexmixer EtOH / RNA-løsning og fjerne passende størrelse. This EtOH/RNA solution stored at 20oC or lower, is stable for years. Denne EtOH / RNA løsning opbevares ved 20 oC eller lavere, er stabil i årevis.

See: Se også:

RNA Protocols RNA protokoller

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik