Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

RNA Protocols RNA protokoller

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatik

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Nyheder

Northern Blot Northern Blot

Copyright 2007 - Molecular Station Copyright 2007 - Molekylær Station

AUDIO AUDIO Listen to a detailed Northern Blot Explanation ! Lyt til en detaljeret Northern Blot Forklaring!

History of Northern Blotting History of Northern blotting

Northern blotting is an RNA blotting technique which was developed in 1977 by Alwine et al. Northern blotting er en RNA-blotting teknik, der blev udviklet i 1977 af Alwine et al. at Stanford University (ref:1). på Stanford University (ref: 1). It was named after the Southern blot technique which blots for DNA, invented by Edwin M. Southern in 1975. Western blot , a method for blotting for proteins is also a play on the Southern blot naming and was named in 1981 (ref:2). Det var opkaldt efter den sydlige skamplet teknik, der blotting for DNA, opfundet af Edwin M. Southern i 1975. Vestlige skamplet, en metode til blotting for proteiner er også en spiller på den sydlige skamplet navngivning og blev navngivet i 1981 (ref: 2) .

Background Information - Northern Blot Technique Background Information - Northern Blot Technique

Northern analysis despite its age in the high tech world of Real Time PCR, nuclease protection assays (RPAs) and microarrays, is still the gold-standard for the detection and quantitation of mRNA levels. Northern analyse trods af sin alder i den højteknologiske verden af Real Time PCR, nuclease beskyttelse assays (RPAs) og microarrays, er stadig guld-standard for påvisning og quantitation af mRNA niveauer. This is because northern blot analysis allows a direct comparison of the messenger RNA abundance between samples on a single membrane. Dette skyldes nordlige skamplet analyse giver mulighed for en direkte sammenligning af messenger RNA overflod mellem prøver på en enkelt membran.

In northern blot the main difference between the other blotting techniques is that RNA is the factor being detected. I det nordlige skamplet den væsentligste forskel mellem de øvrige blotting teknik er, at RNA er den faktor bliver opdaget. Also, due to the fact that RNA is usually single-stranded, it creates complex secondary structures which affect its migration and hence denaturing conditions are used to run the gels (unlike Southern). Desuden skyldes, at RNA er normalt enkelt strandet, det skaber komplekse sekundære strukturer, der påvirker dets migration og dermed denaturering betingelser er vant til at køre geler (i modsætning til det sydlige).

RNA is separated out by RNA gel electrophoresis (usually agarose gel electrophoresis), subsequent transfer to membrane, hybridization with probe, and finally detection. RNA er adskilt af RNA gelelektroforese (normalt agarosegel elektroforese), efterfølgende overførsel til membran, hybridisering med sonde, og endelig påvisning.

Similarly to Southern blotting, the hybridization probes may be DNA or RNA in northern blotting. Tilsvarende til Southern blotting, krydsning sonder kan DNA-eller RNA i det nordlige blotting.

A variant of the procedure known as the reverse northern blot was occasionally (although, infrequently) used. En variant af den procedure, kendt som den omvendte nordlige skamplet var lejlighedsvis (selv, sjældent) brugt. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. I denne procedure, substrat nukleinsyre (det er fastgjort til membranen) er en samling af isolerede DNA-fragmenter, og sonden er RNA ekstraheres fra en vævs-og radioaktivt mærket.

The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Brugen af DNA-microarrays, der kommer i udbredt anvendelse i slutningen af 1990'erne og begyndelsen af 2000'erne er mere beslægtet med den omvendte procedure, idet de indebærer brug af isolerede DNA-fragmenter anbringes på et underlag, og krydsning med en sonde, der er fremstillet af cellulære RNA . Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled the one-at-a-time study of gene expression using northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored Den omvendte procedure, om end oprindeligt ualmindeligt, gjorde det muligt for en-at-a-tid undersøgelse af genekspression vha. nordlige analyse for at udvikle sig til genekspression profilering, hvor mange (måske alle) af gener i en organisme kan få deres ytringsfrihed overvåges

Applications of the Northern Blot Ansøgninger af den nordlige Blot

Northern blots have been superceded in most areas by Real Time PCR and microarray approaches. Northern blotting er blevet erstattet i de fleste områder af Real Time PCR og microarray tilgange. It is not often used for clinical or diagnostic purposes. Det er ikke ofte anvendes til klinisk eller diagnostisk formål.

The northern blot protocol and its variations are used however in molecular biology research to: Den nordlige skamplet protokollen og dens varianter, anvendes dog i molekylærbiologisk forskning til:

• a gold-standard for the direct study of gene expression at the level of mRNA (messenger RNA transcripts). en gold-standard for den direkte undersøgelse af genekspression på mRNA (messenger RNA-transkripter).
• detection of mRNA transcript size påvisning af mRNA udskrift størrelse
• study RNA degradation Undersøgelsen RNA nedbrydning
• study RNA splicing - can detect alternatively spliced transcripts Undersøgelsen RNA splicing - kan afsløre alternativt splejset transkriptioner
• study RNA half-life Undersøgelsen RNA halveringstid
• study IRES (internal ribosomal entry site) - to remove possibility of RNA digestion vs 2nd cistron translation. Undersøgelsen IRES (intern ribosomale indrejse site) - at fjerne muligheden for RNA fordøjelse vs 2nd cistron oversættelse.
• often used to confirm and check transgenic / knockout mice (animals) ofte anvendes til at bekræfte og kontrollere transgene / knockout mus (dyr)

Disadvantages of Northern Blotting Ulemper ved Northern blotting

The disadvantages of using northern blotting include: Ulemperne ved hjælp nordlige blotting omfatte:

• Often radioactivity is used. Ofte radioaktivitet er brugt. This prevents ease of performing it, use and disposal. Dette forhindrer nem at udføre det, brug og bortskaffelse. New methods of non-radioactive detection have been generated allowing non-radioactive detection. Nye metoder af ikke-radioaktivt afsløring er blevet genereret tillader ikke-radioaktivt afsløring. See Pierce. Se Pierce.
• The whole process of northern blotting takes a long time usually, from sample preparation through to detection. Hele processen i det nordlige blotting tager lang tid, normalt fra prøveforberedelse igennem til påvisning.
• If RNA samples are even slightly degraded by RNases, the quality of the data and quantitation of expression is quite negatively affected. Hvis RNA-prøver er endnu lidt nedbrydes af RNases, kvaliteten af data og quantitation udtryksform er ganske negativt påvirket.
• The standard northern blot method is relatively less sensitive than nuclease protection assays and RT-PCR. Standarden nordlige skamplet metode er relativt mindre følsomme end nuclease beskyttelse assays og RT-PCR. The sensitivity of northern blots may be increased with the use of nylon positively-charged membranes, use of a highly specific antisense probe. Følsomheden i det nordlige blotting kan forhøjes med brugen af nylon positivt ladede membraner, brug af en meget specifikke antisense sonde.
• Detection with multiple probes is a problem. Detection med flere sonder er et problem. Often, the membranes must be stripped before hybridization and detection with a second probe. Ofte er de membraner skal fjernes før hybridisering og påvisning med en anden sonde. This is a problem as harsh conditions are required to strip off probes from the blot and is also time consuming. Dette er et problem som barske betingelser er forpligtet til strip off-sonder fra skamplet og er også tidskrævende. Also, there is a limit to the amount of times a blot may be stripped. Desuden er der en grænse for størrelsen af gange en skamplet kan blive strippet.

Advantages of Northern Blotting Fordele ved Northern blotting

The advantages of northern blots include: Fordelene ved det nordlige blotting omfatte:

• It is a widely accepted and well regarded method Det er et almindeligt accepteret og godt betragtes metode
• northern blotting is a straight-forward method nordlige blotting er en straight-forward metoden
• Often it is used as a confirmation or check Det er ofte brugt som en bekræftelse eller check
• Often a gold-standard Ofte kan et gold-standard
• it is a versatile protocol as it can allow the usage of many types of probes (vs Real time PCR) including: radiolabeled and non-radiolabeled, in vitro transcribed RNA and even oligonucleotides such as primers. det er en alsidig protokol som den kan tillade brug af mange typer af sonder (vs Real time PCR), herunder radioaktivt og ikke-radioaktivt, in vitro transskriberede RNA og endda oligonucleotides såsom primere.
• Sequences with even partial homology, unlike real time PCR or other methods can be used as hybridization probes (ie sequence from different species for homology analysis, or even genomic fragments can be used). Sekvenser med endog delvis homology, i modsætning til real time PCR eller andre metoder kan anvendes som krydsning sonder (dvs. sekvenser fra forskellige arter, for homology analyse, eller endog genomiske fragmenter kan bruges).

Northern Blot Protocol Northern Blot protokol

As mentioned the steps in northern blotting include: Som nævnt trinene i det nordlige blotting omfatte:

1. RNA isolation RNA isolation
2. Gel electrophoresis of RNA for separation Gel elektroforese af RNA for adskillelse
3. Transfer to membrane (usually positively charged nylon as RNA is negatively charged) Overførsel til membran (normalt positivt ladede nylon som RNA er negativt ladet)
4. Cross-linking of RNA to membrane (usually by UV-crosslinking or chemical means) Tvaerbinding af RNA til membran (normalt ved UV-crosslinking eller kemiske midler)
5. Hybridization Hybridisering
6. Detection

Materials Needed for Northern Blot Protocol Materialer, der er nødvendige for Northern Blot protokol

Buffer Recipes Buffer Opskrifter

20XSSPE (500 ml) 20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl : 105.2 g 3.6M NaCl: 105,2 g
• 0. 2M phosphate buffer pH 7.0: 100mL of 1M 2M fosfatbuffer, pH 7,0: 100 ml af 1M
• 20mM EDTA: 20mL of 0.5M 20mm EDTA: -20 ml af 0.5M

Phosphate buffer pH7.0 (500ml) Fosfatbuffer pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL of 1M NaH2PO4 (monobasisk) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL of 1M Na2H2PO4 (Dibasisk) 360 ml 1M
• pH to 7.0 after both are added pH til 7,0 efter begge er tilføjet

Hybridization buffer =HB (100mls) Hybridiseringsbuffer = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10% 2% SDS: 20 ml 10%

* *Right before using add 1000ug denatured RNAse free CT DNA (heat to 95o for 3 min to denature) 5000ug yeast RNA * * Lige før du bruger tilføje 1000ug denatureret RNAse gratis CT DNA (varme til 95o i 3 min til denaturere) 5000ug gær RNA

WASH: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS Vask: 2x SSPE + 0,1% SDS (500 ml) 50 ml 20X 5 ml 10% SDS = 0,1% SDS

Running buffer for RNA gel (1L) Running buffer for RNA gel (1L)

• 100 mls 10X MOPS 100 ml 10X MOPS
• 52. 6 mls of formaldehyde 6 ml af formaldehyd
• 847. 4 mls H20 4 ml H20

RNA Gel (70ml) RNA Gel (70ml)

• 0.84 g agarose 0,84 g agarose
• 7 mls 10x MOPS 7 ml 10x MOPS
• 58.38 mls H2O 58,38 ml H2O
• Put gel in solution by heating. Put gel i opløsning ved opvarmning. Let gel cool to 60°C, then add Formaldehyde to equal 0.66M --3.78 mls Lad gelen afkøles til 60 ° C, derefter tilføje formaldehyd til lige 0.66M - 3,78 ml
• Pour gel in fume hood if possible Pour gel i røg hætte hvis det er muligt

RNA Samples for Northern Blot RNA Prøver for Northern Blot

See RNA Isolation and Purification Se RNA Dyrkning og rensning

RNA Gel RNA Gel

After isolating RNA, the RNA must be separated out on a gel (usually agarose). Efter at isolere RNA, RNA skal adskilles på en gel (normalt agarose).

see RNA gels se RNA geler

Northern Blot Transfer to Nylon Membrane Protocol Northern Blot Overførsel til Nylon Membrane protokol

After running the RNA gel , wash the gel with distilled water put on posiblotter. Efter at køre RNA-gel, vask gelen med destilleret vand bringes på posiblotter.

Layers from top to bottom are: Lag fra top til bund er:

• sponge svamp
• 3-4 Whatman papers cut to size ( both of these up above should be soaked in 10X SSPE but not dripping) 3-4 Whatman papirer tilskåret i størrelse (begge disse op ovenfor bør Soaked in 10X SSPE men ikke dryppende)
• gel mask. gel-maske.
• Note: Make sure the gel overlays the mask so that it can seal membrane with line of the top of gel and the right top corner marked 3 pieces slightly bigger 3M paper hard plastic with holes Bemærk: Sørg for, gel overlejringer den maske, så den kan forsegle membran med linje i toppen af gelen og retten øverste hjørne markeret 3 stykker lidt større 3M papir hård plast med huller

Clamp on and make sure there is a good seal. Clamp om og foretag sikker på, at der er en god forsegling. Use 75-80 mm Hg of pressure for 1 hr or more. Brug 75-80 mm Hg tryk i 1 time eller mere.

Blot membrane dry Blot membran tørt

Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot Protocol Tvaerbinding Nylon Membraner - Northern Blot protokol

• Cut top right corner wrap in saran wrap. Cut øverste højre hjørne wrap i saran wrap.
• UV irradiate with RNA side down for 2.5 min. UV-bestråle med RNA side ned til 2,5 min.
• Wash for a couple of minutes in hot 2X SSPE/0.1% SDS solution (Microwave solution for 30-45 seconds at 50% power. Vask i et par minutter i varm 2X SSPE/0.1% SDS opløsning (Microwave løsning for 30-45 sekunder ved 50% effekt.
• Air dry Air tørre

Pre Hybridization for Northern Blot Pre hybridisering for Northern Blot

1. Pre Hybridize for 6 hours-overnight Pre krydse sig for 6 timer-overnatning
2. Set oven to 65°C heat HB buffer to put SDS in solution Sæt ovnen på 65 ° C varme HB buffer til at sætte SDS i opløsning
3. Roll up membrane inside piece of mesh and put into hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS) Roll op membran inde stykke maske og tages i hybridizaton slange (2X SSPE/0.1% SDS)
4. Check for air bubbles Kontroller for luftbobler
5. Put tube in oven balanced with another tube on opposite side Sæt røret i ovnen afbalanceret med et andet rør på modsatte side

Labeling probe for Northern Blotting Labeling sonde til Northern blotting

1. Put 25ng of probe in a total volume of 11uL with ddH2O Put 25ng af sonden i en samlet volumen på 11uL med ddH2O
2. Denature @ 95°C 3 min. Denaturere @ 95 ° C 3 min. This is to get the probe single stranded and remove secondary structure which would prevent efficient hybridization. Dette er for at få sonden enkelt strandede og fjerne sekundær struktur, som ville forhindre effektiv hybridisering.
3. Quick cool on wet ice. Quick cool på våd is. This is to keep the probe single stranded, free of secondary structure and not allow reannealing (or reforming of secondary structures). Dette er at holde sonden enkelt strandet, fri af sekundær struktur og ikke tillade reannealing (eller reformering af sekundære strukturer).
4. Add 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul total Tilføj 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radioaktivt P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul samlede
5. Incubate 10-15 min 37°C Inkubér 10-15 min 37 ° C
6. Add 28uL of 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, to 20ul reaction. Tilføj 28uL af 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, at 20ul reaktion.
7. Pre-spin G-25 Sephadex column for 1 minute. Pre-spin G-25 Sephadex kolonne for 1 minut.
8. Add 50ul sample to column and spin for 2.5 min in clinical centrifuge. Tilføj 50ul prøve at spalte og spin for 2,5 min i kliniske centrifugeres. This is to purify probe away from label. Dette er at rense sonden væk fra etiketten.
9. Throw away column. Smider kolonne.
10. Mix in a new tube 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA in a 0.5mL tube. Bland i en ny tube 100ug CT-DNA 50ug Gær RNA i en 0,5 ml rør.
11. Denature 95° 3 min Denaturere 95 ° 3 min
12. Add to hybrid tube mix, hybridize at 65°C for 20-36 hrs Føj til hybride tube mix, krydse sig på 65 ° C i 20-36 timer

Post hybridization Protocol for Northern Blotting Post krydsning protokollen for Northern blotting

Hybridize for 36-48 hours then wash. Krydse sig for 36-48 timer derefter vask.

1. Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (wash) heat up to 65° C (Use microwave or water bath to warm solution) Varm op 2X SSPE/0.1% SDS (vask) varme op til 65 ° C (Brug mikrobølgeovn eller vandbad til varme opløsning)
2. Take out tube and pour liquid into hot radioactive waste container. Tag ud på røret og hælde væske i varmt radioaktivt affald container.
3. Rinse with 10ml wash do this twice and pour waste out. Skylles med 10 ml vask gøre dette to gange og hæld affald ud.
4. Put in 40 to 50 mls of wash and shake vigoursly. Put i 40 til 50 ml af vaske og ryste vigoursly.
5. Put in hybridization oven for 20 min rotating. Put i krydsning ovnen i 20 min roterende.
6. Pour down sink Pour ned vasken
7. Another 40-50mls and shake in oven. En anden 40-50mls og ryste i ovnen.
8. Pour out to waste container (sink if not hot or toxic) and make sure it is no longer hot and then take out membrane. Pour ud til affald container (synker, hvis ikke varmt eller giftige) og sørg for, at det ikke længere er varmt og derefter tage ud membran.
9. Wash on shaker with 0.2XSSPE w/ 0.1% SDS at RT for 15 min. Vask på rysteapparat med 0.2XSSPE w / 0,1% SDS på RT i 15 min.
10. Air dry Air tørre
11. Expose

Tips for Northern Blot Tips til Northern Blot

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Hvis du i øjeblikket har en foretrukket metode til isolering af RNA, fortsætte med at bruge det.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Altid køre en agarosegel af dine RNA til at vurdere kvaliteten. Do not only rely on spectrophotometry results. Må ikke kun stole på spektrofotometri resultater.

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Brug DEPC behandlet vand og bages glasvarer. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Denne løsning, absolut positivt skal Rnase fri. Rnase is everywhere! Rnase findes overalt! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Brug handsker, brug kun bagt glasvarer, eller jomfru plast. DePC treat your water, buffers (except Tris). DEPC behandle din vand, buffere (undtagen Tris). Be very careful. Vær meget forsigtig.

Troubleshooting Northern Blots Fejlfinding Northern blotting

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Hvis du i øjeblikket har en foretrukket metode til isolering af RNA, fortsætte med at bruge det.

Discuss and post questions about this in the Northern Blot Forum . Diskutere og stille spørgsmål om dette i den nordlige Blot Forum.

Northern Blot References Northern Blot Referencer

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". "Metode til påvisning af specifikke RNAs i agarose geler ved overførsel til diazobenzyloxymethyl-papir og krydsning med DNA-sonder". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (12): 5350-4. USA 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). W. Neal Burnette (april 1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". " 'Western blotting': elektroforese overførsel af proteiner fra natriumdodecylsulfat - polyacrylamid geler til umodificeret nitrocellulose og radiografisk påvisning af antistof og radioiodinated protein A". Anal Biochem 112 (2): 195-203. Anal Biochem 112 (2): 195-203.