Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark Site

Real-time PCR Real-time PCR

Real time and Quantitative PCR Real tid og Kvantitativ PCR

Introduction to Real-Time PCR Introduktion til Real-Time PCR

Real-time PCR is a type of quantitative PCR which measures the amount of cDNA or mRNA in a sample, either from a population of cells (tissue or cell culture), or recently even from a single cell. Real-time is used commonly to determine the expression of a gene's mRNA, and its expression levels (copy number of mRNA) during certain conditions (such as treating cells with a drug).  Real-time PCR can be used to compare normal (control) samples to disease samples, giving an idea as to expression changes which occur with pathogenesis.  Real-time PCR due to its sensitivity is also used in the detection of pathogens in the blood such as viruses. Real-time PCR er en type af kvantitative PCR som måler mængden af cDNA eller mRNA i en prøve, enten fra en population af celler (væv eller cellekultur), eller for nylig selv fra en enkelt celle. Real-time bruges almindeligvis til bestemme udtryk for et gen's mRNA, og dens udtryk niveauer (antal kopier af mRNA) under visse betingelser (såsom at behandle celler med et narkotikum). realtids-PCR kan bruges til at sammenligne den normale (kontrol) prøver at sygdommen prøver, der giver en idé, at udtrykket ændringer, der sker med patogenese. realtids-PCR på grund af dens følsomhed er også anvendt i påvisning af patogener i blodet som virus.

The development of real-time quantitative PCR has eliminated the variability traditionally associated with quantitative PCR, thus allowing the Udviklingen af real-time kvantitativ PCR har ophævet variabilitet traditionelt er forbundet med kvantitative PCR, hvilket gør det muligt at
routine and reliable quantitation of PCR products. rutine og pålidelige quantitation af PCR-produkter.

Table of Contents Indholdsfortegnelse

Introduction to Real-time PCR Introduktion til Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Fordele ved Real-time PCR

History of Real-Time PCR History of Real-Time PCR

Real-time PCR systems Available Real-time PCR systemer Available

Real-time PCR Protocols Real-time PCR-protokoller

Mechanism of Real-time PCR Metode: Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Fordele ved Real-time PCR

Each cell type expressess a set of mRNA molecules, known as a transcriptome.  In response to stimuli, cells are able to up-regulate or down-regulate factors such as protein enzymes inside the cell by regulating the mRNA levels of these factors.  mRNA levels are not always correlated with protein levels so some caution is necessary, however generally mRNA levels do loosely correspond to protein levels.  Measuring the mRNA levels of certain factors inside a cell using real-time pcr is a method which will give clues as to the amounts of these factors or proteins. Hver celle type expressess et sæt af mRNA molekyler, der er kendt som en transcriptome. Som reaktion på stimuli, celler er i stand til at op-regulere eller ned-regulere faktorer såsom protein enzymer inde i cellen ved at regulere mRNA niveauer af disse faktorer. MRNA niveauer er ikke altid korreleret med protein niveauer, så en vis forsigtighed er nødvendig, dog generelt mRNA niveauer gøre løseligt svarer til protein niveauer. Måling af mRNA niveauer af visse faktorer inde i en celle ved hjælp af real-time PCR er en metode, som vil give fingerpeg med hensyn til de beløb, af disse faktorer eller proteiner.

Traditionally, mRNA levels inside the cell were measured using Northern blotting.  This technique is regarded as a gold-standard in the measurement of gene expression/mRNA levels as it uses radiolabeled probe to label the RNA, which is then quantified using a scintillation counter giving very accurate readings. Traditionelt har mRNA niveauer inden i cellen blev målt ved hjælp af Northern blotting. Denne teknik betragtes som en gold-standard i måling af genekspression / mRNA niveauer, som det anvender radioaktivt sonden til at mærke det RNA, som derefter kvantificeres ved hjælp af et Scintillation counter give meget præcise behandlinger. Northern blotting although very accurate had several disadvantages including the use of radioactivity. Northern blotting selvom meget præcis havde flere ulemper, herunder brug af radioaktivitet. Northern blotting required the accurate measurement of mRNA and total RNA from cells extracted in order to compare samples. Northern blotting kræves nøjagtig måling af mRNA og total RNA fra celler, udvindes med henblik på at sammenligne prøverne. This was a problem because although detection methods were very accurate, error could be introduced into Northern blotting (or RNA dot/slot blotting) through differences in total RNA/mRNA levels between samples (ie cell treatments, different tissues, different animals, etc.).  It also required relatively large amounts of RNA which required large numbers of cells. Dette var et problem, fordi selv om påvisningsmetoder var meget nøjagtige, fejl kan blive indført i Northern blotting (eller RNA dot / slot blotting) ved hjælp af forskelle i den samlede RNA / mRNA niveauer mellem prøver (dvs. celle behandlinger, forskellige væv, forskellige dyr osv. ). Desuden kræves forholdsvis store mængder af RNA, som krævede et stort antal celler. Recently, mRNA gene quantification or real-time pcr methods have been improved and are easier to perform and do not require the use of radioactivity.  Researchers often only have access to small amounts of cells especially in the fields of stem cell research and primary cell research, and real-time pcr has made it possible to quantify mRNA levels from even very small numbers of cells and lately even single cells.  However, this extreme sensitivity of real-time pcr methods makes it vital to protect one's samples from contamination, which would lead to false results. For nylig mRNA genet kvantificering eller real-time PCR-metoder er blevet forbedret og er lettere at udføre og ikke kræver brug af radioaktivitet. Forskere ofte kun har adgang til de små mængder af celler, især i de områder af stamcelleforskning og primære celle undersøgelse , Og real-time PCR har gjort det muligt at kvantificere mRNA niveauer fra endog meget lille antal celler og senest er endnu enkelt celler. Men denne ekstreme følsomhed realtids-PCR-metoder gør det afgørende at beskytte ens prøver fra forurening, som ville føre til falske resultater. Current real-time pcr methods and systems also do not require the measurement of mRNA or cDNA sample concentrations before real-time pcr is conducted. Nuværende realtids-PCR-metoder og systemer heller ikke kræve måling af mRNA eller cDNA prøve koncentrationer før realtids-PCR gennemføres.

History of Real-Time PCR History of Real-Time PCR

Higuchi et al.1,2 pioneered the analysis of PCR kinetics by constructing a system that detects PCR products as Higuchi et al.1, 2 banebrydende analyse af PCR kinetik ved at opbygge et system, der registrerer PCR-produkter som
they accumulate. de ophobes. This “real-time” system includes the intercalator ethidium bromide in each amplification reaction, Denne "real-time"-systemet omfatter intercalator ethidiumbromid i hver forstærkning reaktion,
an adapted thermal cycler to irradiate the samples with ultraviolet light, and detection of the resulting fluorescence en tilpasset thermal cycler til at bestråle stikprøver med ultraviolet lys, og afsløring af den resulterende fluorescens
with a computer-controlled cooled CCD camera. med en computer-kontrollerede nedkølet CCD kamera. Amplification produces increasing amounts of double-stranded Forstærkning producerer stigende mængder af dobbelt-strandede
DNA, which binds ethidium bromide, resulting in an increase in fluorescence. DNA, der binder ethidiumbromid, hvilket resulterer i en stigning i fluorescens. By plotting the increase in fluorescence Ved markering af stigningen i fluorescens
versus cycle number, the system produces amplification plots that provide a more complete picture of the versus cyklus nummer, systemet producerer amplifikation jordlodder, som giver et mere komplet billede af
PCR process than assaying product accumulation after a fixed number of cycles. PCR-processen end assaying produkt ophobning efter et fast antal runder.

External sites: see Real Time PCR at Real Time PCR Info! Eksterne websteder: se Real Time PCR på Real Time PCR Info!

References for Real-Time PCR Henvisninger til Real-Time PCR

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, and Griffith, R. 1992. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS og Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Samtidig opformering og påvisning af specifikke DNA-sekvenser.
Biotechnology 10:413–417. Biotechnology 10:413-417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., og Watson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Kinetisk PCR: Real tidstro overvågning af DNA-forstærkning reaktioner.
Biotechnology 11:1026–1030. Bioteknologi 11:1026-1030.

Real-Time PCR Protocols Real-Time PCR-protokoller	Real-Time PCR Bioinformatics and Databases Real-Time PCR bioinformatik og databaser	Learn about Real-Time PCR Lær om Real-Time PCR	Real-Time PCR Kits and Products Real-Time PCR Kits og Produkter	Real-Time PCR Forum Real-Time PCR Forum	Real-Time PCR Books Real-Time PCR Bøger