Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatik, protokollerne, DNA-RNA-Protein Proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologi Home protokoller Bioinformatic Tools Biologisk Forums Molekylær Biologi Encyclopaedia Molekylær Biologi Images Bookmark Us!

home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php home> protein> fejlfinding-western-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molekylær Biologi Home Science News Science Videos DNA-RNA-Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatik Lab Equipment Molekylærbiologiske Teknikker Molekylær Biologi produkter og tjenester i tilknytning Biologi Links

Molecular Biology Blog Molekylær Biologi Blog

Send this page to a friend Send denne side til en ven

Intracellular Stations Intracellulær Stationer

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody Botany fælles Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology og Kultur gelelektroforese Histologi Microarrays Immunology Mass Spectrometry Mikrobiologi molekylær billeddannelse Peptide Proteomics Protein microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi og siRNA stamcellebiologiske transfektering Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot protokoller

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkter

Western Blot Books Western Blot Bøger

Western Blot Troubleshooting Western Blot Fejlfinding

Western Blot Books Western Blot Bøger

Troubleshooting Western Blots Fejlfinding Western blotting

The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! Molekylære Station Guide til Western blotting problemer og løsninger: Fælles Western Blot problemer og løsninger for dem!

Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Du kan kontakte os med dine ideer, hvis du kan føje til denne vejledning.

What is your western blot problem? - Organized Alphabetically Hvad er din western blotting problem? - I alfabetisk rækkefølge

Fuzzy Bands Fuzzy Bands

Low Signal Lavt signal

Membrane is Glowing in the Dark Room Membrane er Glowing i det mørke rum

High Background Høje Baggrund

Spots on Film Spots om Film

Too many Bands in Western Blot Alt for mange Bands i Western Blot

Weak Signal Svag Signal

Troubleshooting Western Blots Problem: Fejlfinding Western blotting Problem:

Spots on Film (missing bands) : Spots om Film (mangler bands):

- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Dårlig Transfer skyldes luftbobler under overførsel til membran

- dirty film when adding to the developer -- Beskidte film, når tilføjelse til bygherren

- developer rolls are dirty -- Udvikler ruller er beskidte

Solution to spots on film: Løsning på pletterne på film:

- use a pasteur pipette as a roller. -- Brug en Pasteur-pipette som en rullelejer. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. roll membranen og gel før overførsel til fjerne bobler. keep membrane and materials wet. holde membranen og materialer våd.

- keep film clean before adding to the developer -- Opbevare film rene, før du tilføjer til bygherren

Troubleshooting Western Blots Problem: Fejlfinding Western blotting Problem:

Too Many Bands in Western Blot : Alt for mange Bands i Western Blot:

- usually due to many non-specific bands -- Normalt på grund af mange ikke-specifikke frekvensbånd

- poor primary antibody quality or old antibody -- Fattige primære antistof kvalitet eller gamle antistof

- not enough blocking -- Ikke nok at blokere

- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytiske spaltning af antigen - alle yderligere bands er lavere MW end din protein, (dvs. din protein bliver opdaget, men blev degraderet)

Solutions to too many bands on western blot: Løsninger til alt for mange bands på vestlige skamplet:

- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Køb et andet antistof eller erstatte med et nyt antistof lager

- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Blok med 5% affedtet mælk eller BSA forud for primær. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Hvis du allerede er blokeret, overveje at blokere under den primære og sekundære antistof inkuberinger og også øger blokering mælk eller BSA koncentration.

- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Opbevare alt på isen, så brug friske prøver, lagre i - 80C, og brug proteasehæmmere såsom PMSF

Troubleshooting Western Blots Problem: Fejlfinding Western blotting Problem:

High background; low signal to noise ratio on Western Blot Høj baggrund; lavt signal / støjforhold på Western Blot

- black or every dark film; film was exposed too long -- Sort eller hvert mørke film; filmen blev udsat for lang

- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blokering var utilstrækkelige, ikke-specifikke binding af antistof primære og sekundære antistoffer var ikke vasket helt

- washing was insufficient -- Vask var utilstrækkelig

- film glows in dark! -- Film gløder i mørke! - too high secondary or primary dilutions -- For høj sekundær eller primær fortyndinger

Solutions to Dark Film: Løsninger til Dark Film:

- expose for less time, decrease exposure time -- Udsætte sig for mindre tid, fald eksponeringstid

- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Øge blokering varigheden af fedtfrie mælketørstof 5% inkubation eller øge koncentrationen.

- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Også kan du prøve at blokere med hele serum i vaertslandet dyr med (eller før) det sekundære antistof

- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Øge vask tidspunkter og mængder for at hjælpe med at fjerne eventuelle ikke-specifikke signal på grund af svag antistof bindende.

- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Bruge et stærkere rengøringsmiddel til vask - I stedet for TBST (Tween-20), skal du bruge stærkere rengøringsmidler såsom NP-40 eller SDS, som kan give en mere stringent vask og reducere baggrunden (gør det kun, hvis du båndet er stærk! - Vask også fjerner nogle dit band af interesse!)

- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Meget høj sekundære antistof (eller endda primære) koncentrationen - udføre optimering eksperimenter til at bestemme korrekt antistof fortyndinger. dilute the antibodies further. fortynde antistoffer yderligere.

Troubleshooting Western Blots Problem: Fejlfinding Western blotting Problem:

Low Signal or Weak Signal Lavt signal eller svagt Signal

- due to not enough protein loaded on the gel -- Skyldes ikke nok protein lastes på gelen

- primary antibody is old or not good -- Primære antistof er gamle eller ikke godt

- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Phospho-proteiner normalt har brug for overnatning primære antistof inkubation

- not enough secondary antibody -- Ikke nok sekundære antistof

- over-blocking -- Over-blokerende

- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Udvikling af reagenser er dårlige / du har lavet en fejl ved udarbejdelsen af dem

Solutions to Low Signal or Weak Signal : Løsninger til Lav signal eller Svag Signal:

- load more protein sample onto gel -- Belastning mere protein prøve på gel

- try fresh primary antibody -- Prøv friske primære antistof

- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Inkubér primære antistof overnite for phosphoproteins på 4 grader C (kølerum shaker)

- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- At øge koncentrationen af protein (lyseres prøver i mindre lysisbuffer)

- decrease concentration of blocking agent -- Faldet koncentration af blokerende agent

- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Kontrollere de udvikler reagenser; forberede friske ECL og re-ECL membranen

- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Øge koncentrationen eller længden af den primære antistof inkubationstid

- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Øge koncentrationen eller længden af sekundære antistof inkubationstid

Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands ikke Sharp

- bands smeared due to hot gel -- Bands smeared på grund af varme gel

- bands fuzzy due to high voltage -- Bands fuzzy grund af høj spænding

Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Løsninger til Fuzzy bands og Un-skarpe Bands:

- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Faldet spænding eller strøm, køre i kolde rum, og forberede nye kører buffer. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Varme forårsager gel til at miste sin stivhed og dets løsning effekt)

- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-suge overførsel membranen i de relevante overførsel løsning (bestemt af membranen fabrikanten) for den krævede tidsfrist.