Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark Site

PCR Based Site Directed Mutagenesis PCR Baseret Site Instrueret Mutagenese

Polymerase Chain Reaction Site Mutagenesis Polymerase Chain Reaction Site Mutagenese

Learn about PCR based site directed mutagenesis. Lær om PCR-baserede websted dirigeret mutagenese.

(Refer to Diagram Below) (Se figur)

Begin first with a plasmid containing a gene with a TAC tyrosine codon that we want to alter to a TTC phenylalanine codon. Begynd først med et plasmid indeholdende et gen med en TAC tyrosin codon, at vi ønsker at ændre til et TTC phenylalanin codon. In order to accomplish this we need to change the AT pair (blue) in the original to a TA pair. For at opnå dette er vi nødt til at ændre AT pair (blå) i den oprindelige til en TA par. This plasmid was isolated from a normal strain of E.coli that methylates the As of GATC sequences. Dette plasmid blev isoleret fra en normal stamme af E. coli, at methylates AS af GATC sekvenser. The methyl groups are indicated in yellow. De methyl grupper er angivet med gult. The following steps are performed to accomplish this: Følgende trin er udført med henblik på at opnå dette:

• Heat the plasmid to separate its strands. Varm plasmid at adskille sine indsatsområder.
• We then anneal mutagenic primers that contain the TTC codon, or its reverse complement, GAA. Vi så anneal mutagene primere, som indeholder TTC codon, eller dens omvendte supplere, GAA. The altered base in each primer is indicated in pink. Den ændrede base i hver primer er angivet i pink.
• We then perform a few rounds of PCR (about 8) with the mutagenic primers to amplify the plasmid with the altered codon. Vi udfør derefter et par runder af PCR (ca. 8) med mutagene primere til at uddybe plasmidet med den ændrede codon. We use a heat stable DNA polymerase, such as Pfu polymerase, to minimize mistakes in copying the plasmid. Vi bruger en varme stabilt DNA-polymerase, såsom Pfu polymerase, for at minimere fejl i kopiering plasmidet.
• We then treat the DNA in the PCR reaction with DpnI to digest the methylated wild-type DNA. Vi derefter behandle DNA i PCR-reaktion med DpnI til at fordøje de denatureret wild-type DNA. Since the PCR product was made in vitro, it is not methylated and is not cut. Da PCR-produktet blev fremstillet in vitro, er det ikke denatureret og ikke er skåret. Lastly we transform E. coli cells with the treated DNA. Endelig vi omdanne E. coli celler med det behandlede DNA. In principle, only the mutated DNA survives to transform. I princippet er det kun den muterede DNA overlever at omdanne. This is checked by sequencing the plasmid DNA from several clones. Dette er kontrolleret af sekventering plasmidet DNA fra flere kloner.



Factors for a Successful PCR Faktorer for en vellykket PCR

Can't Find Your Problem? Ikke kan finde dit problem? Make sure you see the PCR Forum for PCR troubleshooting and solutions to common problems. Sørg for, at du ser PCR Forum for PCR fejlfinding og løsninger på fælles problemer. You can also post questions to other researchers by simply registering and then clicking on Post New Thread or the question mark below! Du kan også stille spørgsmål til andre forskere ved blot at registrere og derefter klikke på Post New Thread eller det pågældende mærke nedenfor!

PCR Articles PCR-artikler

PCR Troubleshooting PCR Fejlfinding

PCR History PCR Historie

PCR Primer Design PCR Primer Design

Primer Extension Primer Forlængelse

PCR Enzymes PCR Enzymer

Factors for Successful PCR Faktorer for vellykket PCR

PCR Based Site Directed Mutagenesis PCR Baseret Site Instrueret Mutagenese

Analysis of PCR Reactions Analyse af PCR-reaktioner

Real Time PCR Real Time PCR

Mutagenesis Forum Topics Mutagenese Forum Emner

Threads Tråde
Thread Title / Poster Tråd Titel / Plakat	Last Post Last Post	Replies Svar	Views
please help me-basic information about site-directed mutagenesis PCR behage hjælp mig-grundlæggende oplysninger om webstedsmålrettede dirigeret mutagenese PCR trypsin trypsin	05-01-2008 06:21 PM 05-01-2008 06:21 PM by kmunson779 » ved kmunson779 »	1	146
site directed mutagenesis using Invitrogen Genetailor site dirigeret mutagenese ved hjælp Invitrogen Genetailor satishreddy27 satishreddy27	06-19-2007 03:34 PM 06-19-2007 03:34 PM by satishreddy27 » ved satishreddy27 »	0	531

You must REGISTER NOW to post a help question in the Gel Electrophoresis Forum. Du skal registrere dig nu for at sende en hjælp spørgsmål i gelelektroforese Forum. Login now if you have already registered. Log ind nu, hvis du allerede har registreret.

PCR Forum Topics PCR Forum Emner

Rt-pcr In RT-PCR ,wih bandf of my intrest we also got two extra light band.how can i improve my result.should i decrease my primer concentration?or should i... RT-PCR I RT-PCR, wih bandf af min interesse vi også fik to ekstra lys band.how kan jeg forbedre mit result.should i fald min primer koncentration? Eller burde i. ..
GSTP1 promotor - unspecific product Hello, I have a problem with interpretation of PCR products’ length. GSTP1 promotoren - lidt konkret produkt Hej, jeg har et problem med fortolkningen af PCR-produkter «længde. The length of a template DNA sequence (human GSTP1 promotor) is about 1650bp... Længden af en skabelon DNA-sekvens (menneskelige GSTP1 promotoren) er ca 1650bp ...
New to PCR techniques Hello there! Ny på PCR teknikker Hallo! my name is 'Dare and I'm doing my undergraduate project on Genetic characterization of chickens with mtDNA. mit navn er 'Dare og jeg gør mit undergraduate projekt om Genetisk karakterisering af kyllinger med mtDNA. I would really appreciate... Jeg vil virkelig sætte pris på ...
PCR Troubleshooting Guide Hi everyone, we are trying to setup a PCR Troubleshooting Guide. PCR Troubleshooting Guide Hej alle, vi forsøger at setup en PCR Troubleshooting Guide. Please help by posting common problems and their solutions here. Please hjælpe ved udstationering fælles problemer og deres løsninger her. thanks:notworthy: tak: notworthy:
PCR contamination I have a problem during PCR program. PCR-kontamination jeg har et problem under PCR-programmet. add templete DNA, dNTP, primer, polymerase, etc..to ep tube. tilføje templete DNA, dNTP, primer, polymerase mv. til EP rør. then I forgot to add oiling UU:mellow: so.. så jeg glemte at tilføje olieudskillelse UU: fyldig: så .. I... I. ..
PCR, incomplete products? Hello, I am using iproof high-fedility polymerase to amplify a DNA fragment 6kb in size from a genome. PCR, ufuldstændige produkter? Hej, Jeg bruger iproof høj fedility polymerase til at uddybe en DNA-fragment 6kb i størrelse fra et genom. With Taq that's almost impossible but iproof... Med Taq det er næsten umuligt, men iproof ...
PCR Inhibition by DNA HELLO ALL! PCR Hæmning af DNA HELLO! I have a big pcr problem. Jeg har en stor PCR problem. I am trying to conduct a pcr using plasmid DNA I purified using a Qiagen midi kit. Jeg forsøger at gennemføre en PCR ved anvendelse af plasmid DNA jeg renses ved hjælp af et Qiagen midi kit. I am using this DNA to make... Jeg bruger denne DNA at gøre ...
plz help in these questions 1-What dNTP do for PCR ? plz hjælp i disse spørgsmål 1-Hvad dNTP gøre for PCR? 2- My PCR samples stay at the top of the agarose gel while the ladder showed a complete run? 2 - Min PCR-prøver forblive øverst på agarosegel mens stigen viste en komplet køre?
Re-PCR trouble Hello everyone. Re-PCR problemer Hej alle. I am trying to amplify a gene, and at the same time to introduce point mutations, to enable the digestion with a specific enzyme of... Jeg forsøger at forstærke et gen, og på samme tid at indføre punkt mutationer, således at fordøjelsen med et specifikt enzym af ...
Volume Loss during PCR?!! So I run my PCR tubes for 30 cycles with a volume of 15ul. Bind tab i PCR?! Så jeg køre mit PCR-rør i 30 cyklusser med et volumen på 15ul. All capped tightly, but I end up with 8-10 ul volume after PCR. Alle udjævnede stramt, men jeg ender med 8-10 ul volumen efter PCR. I tried spinning them down... Jeg forsøgte spinding dem ned ...
You must REGISTER NOW to post a question in the PCR Forum by clicking Du skal registrere dig nu for at sende et spørgsmål i PCR-forummet ved at klikke here . her.

View More PCR discussions and troubleshooting in the: PCR Forum Læs mere PCR drøftelser og fejlfinding i: PCR Forum

Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | © 2005-2007 Molekylær Station.com, Alle rettigheder forbeholdt.

Send this page to a friend Send denne side til en ven