Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

Membrane Hybridization to Screen a Library Membrane hybridisering til Screen et bibliotek

Screening Libraries using Membrane Hybridization Screening Biblioteker bruger Membrane hybridisering

Under the conditions of temperature and ion concentration found in cells, DNA is maintained in a duplex (two-stranded) structure by the hydrogen bonds that form betwen the A and T bases and G and C bases in each strand. Under den temperatur-og ion koncentration findes i cellerne, DNA er bevaret i en duplex (to-strandede) struktur af brint obligationer, der danner MELLEM A-og T-baser og G og C-baser i hvert indsatsområde. DNA duplexes can be denatured into single strands by heating them, usually in a dilute salt solution (eg, 0.01 M NaCl), or by raising the pH above 11. DNA duplexes kan denatureres i enkelt strenge ved at opvarme dem, sædvanligvis i en fortyndet saltopløsning (eg, 0,01 M NaCl), eller ved at hæve pH-værdi på over 11. If the temperature is lowered and the ion concentration in the solution is raised, or if the pH is lowered to neutrality, the AT and GC base pairs reform between complementary single strands. Hvis temperaturen er sænket, og ion koncentration i opløsningen er rejst, eller hvis pH er sænket til neutralitet, AT og GC base par reform mellem komplementære enkelt delområder.

This process goes by many names: renaturation, reassociation, hybridization, annealing. Denne proces går mange navne: renaturation, reassociation, hybridisering, annealing. In a mixture of nucleic acids, only complementary single strands (or strands containing complementary regions) will reassociate; the extent of their reassociation is virtually unaffected by the presence of noncomplementary strands. I en blanding af nukleinsyrer, er kun et supplement enkelt delområder (eller dele indeholder komplementære regioner) vil reassociate; omfanget af deres reassociation er stort set upåvirket af tilstedeværelsen af noncomplementary delområder. Such molecular hybridization can take place between two complementary strands of either DNA or RNA, or between an RNA strand and a DNA strand. Sådanne molekylære krydsning kan finde sted mellem to komplementære dele af enten DNA eller RNA eller mellem en RNA-streng og en DNA-streng. To utilize molecular hybridization in the detection of specific DNA clones, single stranded DNA from recombinant DNA molecules is attached to a solid support, commonly a nitrocellulose filter or treated nylon membrane. For at udnytte molekylær hybridisering med hensyn til påvisning af specifikke DNA-kloner, enlige strandede DNA fra rekombinant DNA-molekyler er knyttet til en solid støtte, der almindeligvis en nitrocellulose filter eller behandlet nylon membran. When a solution containing single0stranded nucleic acids is dried on such a membrane, the single strands become irreversibly bound to the solid support in a manner that leaves most of the bases available for hybridization to a complementary strand. Når en opløsning indeholdende single0stranded nukleinsyrer er tørret på en sådan membran, den fælles indsatsområder bliver uigenkaldeligt bundet til den faste støtte på en måde, der efterlader de fleste af baser til rådighed for krydsning til en supplerende indsatsområde. Although the chemistry if this irreversible binding is not well understood, the procedure is very useful. Selv om kemi, hvis denne uoprettelige bindingen er ikke godt forstået, at proceduren er meget nyttigt. The membrane is then incubated in a solution containing radioactively labeled single-stranded DNA (or RNA) that is complementary to some of the nucleic acid bound to the membrane. Membranen er derefter inkuberes i en opløsning indeholdende radioaktivt mærket single-strandede DNA (eller RNA), som er et supplement til nogle af nukleinsyre bundet til membranen.

Under hybridization conditions (near neutral pH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), this labeled probe hybridizes to the complementary nucleic acid bound to the membrane. Under krydsning betingelser (nær neutral pH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl) er dette mærket probe hybridizes til supplerende nukleinsyre bundet til membranen. Any excess probe that does not hybridize is washed away, and the labeled hybrids are detected by autoradiography of the filter. Eventuelle overskydende probe, der ikke kunne krydse er skyllet væk, og stemplet hybrider påvises af autoradiography af filteret. The recombinant lamda virions present in plaques of a lawn of E. coli are transferred to a nylon membrane by placing the membrane on the surface of the petri dish. Det rekombinante Lamda virioner stede i sponsorplader i en græsplæne af E. coli er overført til en nylon membran ved at placere membranen på overfladen af petriskålen. Many of the viral particles in each plaque absorb to the surface of the membrane, but many virions remain in the plaques on the surface of the nutrient agar in the petri dish containing a large number of individual lamda clones is reproduced on the surface of the membrane. Mange af de virale partikler i hver plaque absorbere til overfladen af membranen, men mange virioner forblive i sponsorplader på overfladen af det næringsstof agar i petriskålen indeholder et stort antal individuelle Lamda kloner er gengivet på overfladen af membranen .

The original petri dish is refrigerated to store the collection of lamda clones. Den oprindelige petriskålen er nedkølet til at gemme indsamling af Lamda kloner. The membrane is then incubated in an alkaline solution, which disrupts the virions, releasing and denaturing the encapsulated DNA. Membranen er derefter inkuberes i en basisk opløsning, som kan forstyrre den virioner, udleverende og denaturering af indkapslet DNA. The membrane is then dried, fixing the recombinant lamda DNA to the membrane's surface. Membranen er derefter tørrede, om fastsættelse af rekombinant Lamda DNA til membranen overflade. Next, the membrane is incubated with a radiolabeled probe under hybridization conditions. Næste, membranen inkuberes med et radioaktivt sonden under krydsning betingelser. Unhybridized probe is washed away, and the filter is subjected to autoradiography. Unhybridized sonden er skyllet væk, og filteret er udsat for autoradiography.

The appearence of a spot on the autoradiogram indicates the presence of a recombinant lamda clone containing DNA complementary to the probe. Fremkomsten af en spot på autoradiogram indikerer tilstedeværelsen af en rekombinant Lamda klon indeholder DNA supplement til sonden. The position of the spot on the autoradiogram corresponds to the position on the original petri dish where that particular clone formed a plaque. Den holdning i stedet om autoradiogram svarer til den holdning om det oprindelige petriskålen, hvor denne særlige klon dannet en mindeplade. Since the original petri dish still contains many infectioua virions in each plaque, viral particles from the identified clone can be recovered for replacing by aligning the autoradiogram and the petri dish and removing viral particles from the clone corresponding to the spot. Da den oprindelige petriskålen stadig indeholder mange infectioua virioner i hver plade, virale partikler fra de identificerede klon kan genvindes til erstatning ved at rette autoradiogram og petriskålen og fjerne virale partikler fra klon svarende til stedet. A similar technique can be applied for screening a plasmid library in E.coli cells. En lignende teknik kan anvendes til screening en plasmid bibliotek i E. coli celler.