Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

Mass Spectrometry Mass Spectrometry

What is a Mass Spectrometer? Hvad er en Mass Spectrometer?

A mass spectrometer is based on the simple fact that different chemicals have different masses, and this is what determines what chemicals are present in a sample. En masse spektrometer er baseret på den enkle kendsgerning, at forskellige kemikalier har forskellige masse, og det er det, afgør, hvilke kemikalier er til stede i en prøve. There are many types of mass spectrometers that not only analyze the ions differently but produce different types of ions; however they all use electric and magnetic fields to change the path of ions in some way. Der findes mange typer af massespektrometre, at ikke kun analysere ioner forskelligt, men producere forskellige typer af ioner, men de bruger alle elektriske og magnetiske felter til at ændre stien til ioner på en eller anden måde.

During the late 1980s and early 1990s, two new methods of sample ionization caused mass spectrometry to undergo a revolution in biopolymer analysis, namely ESI 38 and MALDI.39 Just over a decade ago, for the first time, mass spectrometric techniques that could measure the molecular masses of femtomole quantities of proteins in excess of 100 kDa, often to better than 0.01% accuracy, became widely available to protein chemists. I slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne, to nye metoder til prøve ionisering forårsaget mass spectrometry skal undergå en revolution i biopolymer analyse, nemlig El 38 og MALDI.39 lidt over et årti siden, for første gang, masse spektrometrisk teknikker, der kan måle molekylære masser af femtomole mængder af proteiner på over 100 kDa, ofte bedre end 0,01% nøjagtighed, blev bredt tilgængelige for protein kemikere. These methods are both successful in forming ions from large, labile biomolecules without significant degradation of the analyte. Disse metoder er både succes med at danne ioner fra store, labile biomolekyler uden væsentlig forringelse af analysanden. Not only are they both sensitive techniques but also speedy – both MS and MS/MS sequence spectra can be acquired within seconds. Ikke alene er de begge følsomme teknikker, men også hurtig - både MS og MS / MS sekvens spektre kan erhverves inden for sekunder. ESI and MALDI, due to their many differences, are complementary and many biopolymer laboratories have access to both techniques. El og MALDI på grund af deres mange forskelle, er komplementære og mange biopolymer laboratorier har adgang til både teknikker.

Sample preparation: 2-Dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry Prøvetilberedning: 2-dimensional elektroforese og Mass Spectrometry

Sample separation, isolation and preparation for the mass spectrometric techniques generally, involves 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), a technique that can separate as many as 5000 different proteins in a single experiment. Eksempel på adskillelse, isolering og forberedelse til den masse spektrometrisk teknikker generelt indebærer 2-DE (2-Dimenisional elektroforese), en teknik, som kan adskille så mange som 5000 forskellige proteiner i et enkelt eksperiment. In general, 2-DE is capable of separating proteins within an isoelectric point (pI) range of 3.5–10 and of molecular masses ranging from 6 to 300 kDa, as well as being able to distinguish between post-translationally modified proteins (eg phosphorylated) and their non-modified companions. I almindelighed, 2-DE er i stand til at adskille proteiner i et isoelectric point (PI) vifte af 3.5-10 og molekylær masser spænder fra 6 til 300 kDa, såvel som at kunne skelne mellem post-translationally modificerede proteiner (f.eks fosforyleret ) Og deres ikke-modificerede følgesvende. Once separated, the protein components are revealed by staining techniques (eg silver stain, fluorescent stain, Coomassie blue) and once located they can then be extracted from the gel. Når adskilt, protein komponenter er afsløret ved farvning teknikker (f.eks sølv pletter, fluorescerende pletter, Coomassie blå) og en gang placeret de kan derefter blive udvundet af gelen. Proteins cannot easily be eluted from gels without the use of detergents, which are detrimental to the mass spectrometric analysis; additionally, large proteins tend to be heterogeneous (eg as a result of glycosylation) and so possesses no single molecular mass which can be related to the corresponding entry in a database. Proteiner ikke let kan elueres fra geler uden brug af rengøringsmidler, hvilket er til skade for den masse spektrometrisk analyse; desuden, store proteiner tendens til at være heterogen (fx som følge af glycosylation) og så besidder ingen enkelt molekylære masse, som kan relateres til den tilsvarende post i en database. To overcome these obstacles, the elution step tends to be accomplished after the protein has been digested by an aqueous acetonitrile wash of an excised gel piece. For at overvinde disse hindringer, eluering skridt tendens til at ske efter protein er blevet fordøjet af en vandig acetonitril vask af en slettet gel stykke. This increases the yield of extraction 5 and by using an in-gel digestion method employing trypsin, which has been described and is widely used as published or with minor modifications, produces a MS-compatible sample from which a protein identification can be made. Dette øger udbyttet af udvinding 5 og ved hjælp af en in-gel fordøjelse metode beskæftiger trypsin, som er blevet beskrevet og er almindeligt anvendt som offentliggøres eller med mindre ændringer, der producerer en MS-kompatibel prøve fra som et protein identifikation kan foretages. The digestion step can be preceded by an optional reduction and alkylation step to cleave and block disulfide bridges that exist between cysteine residues. Fordøjelsesvæsken trin, kan foretages en frivillig reduktion og alkylering skridt til spaltes og blokere disulfid broer, der eksisterer mellem cystein rester. Robotic systems have been developed to automate the excision of protein spots from the 2D-gel, to carry out the subsequent enzymatic digestion and to transfer the samples onto MALDI-MS target plates for the initial MS analysis. Robotic systemer er blevet udviklet for at automatisere excision af protein spots fra 2D-gel, til at udføre den efterfølgende enzymatisk fordøjelse og overføre de prøver på MALDI-MS-målet plader til den oprindelige MS-analyse. For many applications, the peptides recovered from in-gel digestions require concentration and purification before being analysed by mass spectrometry especially if ESI is the ionization method used. For mange ansøgninger, peptider inddrives fra in-gel digestions kræver koncentration og rensning inden analyseres ved massespektrometri især hvis El er den ionisering anvendte metode. Reversed phase high performance liquid Omvendt fase højtydende flydende
chromatography (HPLC) is one method of achieving this; another method involves the use of ZipTips (Millipore) (pipette tips packed with C18 material) or Poros R2 perfusion material (Perseptive Biosystems). kromatografi (HPLC) er en metode til at nå dette; en anden metode indebærer brug af ZipTips (Millipore) (pipettespidser pakket med C18 materiale) eller Poros R2 perfusion materiale (Perseptive Biosystems). Despite its widespread acceptance, the limitations of 2-DE include the exclusion of very small or very large proteins, very acidic or very basic proteins, as well as hydrophobic proteins such as membrane proteins. Trods den udbredte accept af de begrænsninger af 2-DE omfatte udelukkelse af meget små eller meget store proteiner, meget sure eller meget grundlæggende proteiner, såvel som hydrofobe proteiner såsom membran proteiner. It is thought that Det menes at
only 20% of the gel-loaded proteins can be visualised and analysed. kun 20% af gel-loaded proteiner kan synliggøres og analyseres. Other constraints are that the amount of sample that can be loaded is limited causing the non-observance of Andre problemer er, at mængden af prøven, der kan lastes er begrænset årsag til manglende overholdelse af
low concentration proteins and also that the most commonly used staining techniques have non-linear response factors. lav koncentration proteiner og også at de mest almindeligt anvendte farvning teknikker har ikke-lineære respons faktorer. In practice, 2-DE is a labour intensive process involving manual handling steps that offer the opportunity for impurities such as keratin to contaminate the samples. I praksis, 2-DE er en arbejdskraftkrævende proces, der omfatter manuel håndtering skridt at tilbyde mulighed for urenheder såsom keratinfibre til kontaminere prøverne. One 2-D gel will take a day to complete and about one month for a complete structural analysis by MS, although automation can help both the contamination problem and speed up the analysis to some extent. En 2-D gel vil tage en dag til komplet og om en måned for en fuldstændig strukturel analyse af MS, selv om automatisering kan hjælpe både forurening problem og fremskynde analysen til en vis grad.

Alternative protein separation techniques Alternativ protein separationsteknik

Alternative, MS-compatible methods of protein preparation are under development but no one technology has emerged as a universal replacement. Alternativ, MS-kompatible metoder af protein forberedelse er under udvikling, men ingen teknologi er dukket op som et universelt udskiftning. These methods aim generally to interface the protein sample directly to MS/MS analyses thereby eliminating time-consuming sample preparation steps and the need for a preliminary MS analysis. Disse metoder til formål generelt at interface proteinindholdet prøve direkte til MS / MS analyser derved fjerne tidkrævende prøveforberedelse skridt og behovet for en foreløbig MS-analyse. Capillary isoelectric focusing (CIEF)-MS and preparative isoelectric focusing followed by size exclusion chromatography-MS are methods that have been compared in depth with 2-DE in terms of separation effciency, peak capacity, precision and robustness, with the former appearing the more favourable alternative.The direct analysis of complex peptide mixtures from a mixture of proteins using on-line, reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC)-MS/MS has been used successfully as an alternative to 2DE and this has led onto multidimensional chromatography if greater peptide separation is desirable prior to the MS/MS analyses. Kapillarkolonne isoelectric fokus (CIEF)-MS og forberedende isoelectric fokus efterfulgt af størrelse udstødelse kromatografi-MS er metoder, der er blevet sammenlignet i dybden med 2-DE i form af adskillelse effciency, peak kapacitet, præcision og robusthed, med de tidligere vises den mere gunstige alternative.The direkte analyse af komplekse peptid blandinger fra en blanding af proteiner ved hjælp af on-line, omvendt fase højtydende væskekromatografi (HPLC) -MS/MS har været anvendt med succes som et alternativ til 2DE og dette har ført til multidimensional kromatografi hvis større peptid adskillelse er ønskeligt forud for MS / MS analyser. Examples of two dimensional chromatography include anion or cation exchange followed by reversed phase HPLC and size exclusion chromatography followed by reversed phase HPLC. Eksempler på to dimensionel kromatografi omfatte anion eller kationbytter fulgt ved omvendt fase HPLC og størrelse udstødelse kromatografi efterfulgt af omvendt fase HPLC. Another, alternative approach has been to use combined solid-phase micro-extraction together with capillary electrophoresis(CE) coupled to ESI MS/MS for the analysis of a total protein tryptic digest. Et andet alternativ fremgangsmåde har været at benytte kombineret fast-fase mikro-ekstraktion sammen med kapillar elektroforese (CE) koblet til El MS / MS for analyse af total protein tryptic fordøje. This method afforded high resolution separation of the peptide fragments allowing the identification of 80–90% of the proteins in this particular yeast ribosome complex. Denne metode giver høj opløsning adskillelse af peptid fragmenter gør det muligt at identificere 80-90% af de proteiner i dette særlige gær ribosom kompleks. Coupling microfluidic devices to MS is a further strategy that combines sample handling and separation, as well as interfacing neatly with nano-ESI-MS analysis.A different approach for selective protein fractionation and identification uses ProteinChip technology (Ciphergen) which employs a surface capture method using antibodies or chemically modified surfaces to capture specific classes of proteins which are then analysed by MALDI-MS. Sammenkoble microfluidic udstyr til MS er en yderligere strategi, der kombinerer prøve håndtering og adskillelse, samt sammenknytning pænt med nano-El-MS analysis.A anden tilgang til selektiv protein fraktionering og identifikation bruger ProteinChip teknologi (Ciphergen), som beskæftiger en overflade capture metode ved hjælp af antistoffer eller kemisk modificerede overflader til at indfange særlige klasser af proteiner som derefter analyseret af MALDI-MS. This technique, known as Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI)-MS35, has great potential for the comparison of the protein content of different samples. Denne teknik, kaldet Surface Enhanced Laser desorption ionization (SELDI)-MS35, har et stort potentiale til sammenligning af protein i forskellige prøver.