Molecular Biology Blog Molekylær Biologi Blog

Assaying DNA- Protein Interactions Assaying DNA-Protein Vekselvirkninger

Learn about how to assay DNA-protein interactions. Læs om hvordan du assay DNA-protein interaktioner.

Assaying DNAProtein Interactions Assaying DNAProtein Interaktioner

There are four important techniques for assaying DNA-protein interactions. Der er fire vigtige teknikker til assaying DNA-protein interaktioner. The first two techniques (Filter Binding and Gel Mobility Shift) determine if your DNA is interacting with protein. De første to teknikker (Filter Bindende og Gel Mobility Shift) afgøre, om din DNA er interagere med protein. The other two techniques (DNase Footprinting and DMS Footprinting) indicate where the target site of interaction between protein and DNA lies on the DNA. De to andre teknikker (DNase Footprinting og DMS Footprinting) angive, hvor målet site for interaktion mellem protein og DNA ligger på DNA.

Filter Binding Filter Bindende

Nitrocellulose membrane filters are commonly used to filter-sterilize solutions. Nitrocellulose membranfiltre er almindeligt anvendt til at filtrere-sterilisere løsninger. Nitrocellulose filters can bind DNA, but only under certain conditions. Nitrocellulose filtre kan binde DNA, men kun på visse betingelser. Singlestranded DNA binds readily to nitrocellulose, but double stranded DNA by itself does not. Singlestranded DNA binder let at nitrocellulose, men dobbelt strandede DNA i sig selv ikke gør. On the other hand protein does bind, and if a protein is bound to double-stranded DNA the protein-DNA complex will bind. På den anden side protein ikke bindende, og hvis et protein er bundet til dobbelt strandede DNA det protein-DNA kompleks vil binde. Please refer to Nitrocellulose Filter Binding Assay article for more information. Se Nitrocellulose Filter Bindende analysesystemet artiklen for mere information.

Gel Mobility Shift Gel Mobility Shift

In order to measure DNA-protein interactions this technique relies on the simple fact that a small DNA has a much higher mobility in gel electrophoresis than the same DNA does when it is bound to a protein. For at måle DNA-protein interaktioner denne teknik bygger på den simple kendsgerning, at en lille DNA har en langt højere mobilitet i gelelektroforese end samme DNA gør, når den er bundet til et protein. We therefore can label a sort double stranded DNA fragment, then mix it with a protein, and electrophorese the complex. Derfor kan vi mærke en slags dobbelt strandede DNA-fragment, så bland den med et proteinindhold, og Elektroforesér kompleks. Then we subject the gel in autoradiography to detect the labeled species. Så er vi underlagt gelen i autoradiography at registrere de mærkede arter. The small size of the DNA is important in this assay. Den lille størrelse af DNA er vigtig i denne analyse. If a whole gene were used its mobility would already be very low, and the mobility shift caused by protein binding would be difficult to detect. Hvis en hel genet blev brugt sin mobilitet allerede ville være meget lav, og den mobilitet skift forårsaget af proteinbinding vil være vanskeligt at opdage. Therefore we must know approximately where the protein binds to the DNA so we can prepare a short restriction fragment, or even a synthetic double-stranded oligonucleotide that will contain the target site for the protein, but little else. Derfor må vi vide ca hvor protein binder sig til DNA, så vi kan forberede en kort begrænsning fragment, eller endda et syntetisk dobbelt strandede oligonucleotid, der skal indeholde målet websted for protein, men lidt andet.

DNase Footprinting DNase Footprinting

Once we know that a protein binds to a given DNA we can use footprinting to find out where the target site lies on the DNA. Når vi ved, at et protein bindes til en bestemt DNA vi kan bruge footprinting at finde ud af, hvor målet websted ligger på DNA. Dnase footprinting relies on the fact that a protein, by binding to DNA, covers the binding site and so protects it from attack by Dnase. Dnase footprinting beror på den omstændighed, at et protein, ved at binde sig til DNA, dækker bindende websted, og så beskytter det mod angreb fra Dnase. In this sense it leaves a "footprint" on the DNA. I den forstand at den giver et "fodaftryk" på DNA. The first step in a footprinting experiment is to end-label the DNA. Det første skridt i en footprinting eksperiment er at ende etiket DNA. We can label either strand, but only one per experiment. Vi kan mærke enten streng, men kun én pr eksperiment. Next, we bind the protein to the DNA. Dernæst skal vi forpligte protein til DNA. Then we treat the DNA-protein complex with Dnase I under mild conditions (very little Dnase), so that an average of only one cut occurs per DNA molecule. Så vi behandler DNA-protein kompleks med Dnase I under mild conditions (meget lidt Dnase), således at et gennemsnit på kun en klippe sker pr DNA-molekylet. Next, we remove the protein from the DNA, separate the DNA strands, and electrophorese the resulting fragments on a high resolution polyacylamide gel alongside size markers. Næste, vi fjerner det protein fra DNA, adskille DNA-strenge, og Elektroforesér den resulterende fragmenter på en høj opløsning polyacylamide gel sammen størrelse markører. Fragments will arise from the other end of the DNA as well, but we will not detect them because they are unlabeled. Fragmenter vil opstå fra den anden ende af DNA så godt, men vi vil ikke afsløre dem, fordi de er uden etiket. We always include a control with DNA alone (no protein), and usually use more than one protein concentration so we can see by the gradual disappearance of the bands in the footprint region that protection of the DNA depends on the concentration of the added protein. Vi er altid omfatte en kontrol med DNA alene (ikke protein), og sædvanligvis bruger mere end en protein koncentration, så vi kan se af den gradvise forsvinden af de bands i fodaftryk regionen, at beskyttelsen af DNA afhænger af koncentrationen af den tilsatte protein. The footprint represents the region of DNA protected by the protein, and therefore tells us where the protein binds. Dækningsområdet repræsenterer regionen DNA beskyttet af protein, og derfor fortæller os, hvor det protein binder.

DMS Footprinting DMS Footprinting

Dnase footprinting gives a good idea of the location of the binding site for the protein, but Dnase is a macromolecule and is therefore a rather blunt instrument for probing the fine details of the binding site. Dnase footprinting giver et godt indtryk af placeringen af den bindende websted for protein, men Dnase er et makromolekyle og er derfor en temmelig stumpt instrument til prøver det fine detaljer om den bindende websted. Which means, that there may be gaps in the interaction between protein and DNA that Dnase would not fit into and therefore would not detect. Hvilket betyder, at der kan være huller i samspillet mellem protein og DNA, at Dnase ikke ville passe ind, og derfor ikke ville opdage. Moreover, DNA binding proteins frequently perturb the DNA within the binding region, distorting the double helix. Desuden DNA bindende proteiner ofte forurolige DNA inden den bindende region, fordrejende dobbelt helix. These perturbations are interesting, but are not generally detected by Dnase footprinting because the protein keeps the Dnase away. Disse forstyrrelser er interessante, men de er generelt ikke afsløres ved Dnase footprinting fordi proteinet holder Dnase væk. To do more detailed footprinting, we need a smaller molecule that can fit into the nooks and crannies of the DNA-protein complex and reveal more of the subtleties of the interaction. Du kan gøre mere detaljerede footprinting, har vi brug for et mindre molekyle, der kan passe ind i krinkelkroge af DNA-protein kompleks og afsløre flere af de finesser i samspillet. A favorite tool for this job is the methylating agent dimethylsulfate (DMS). En favorit værktøj til dette job er den methylating agent dimethylsulfate (DMS).

With DMS footprinting we start off in the same way as in Dnase footprinting, by end-labeling the DNA and binding the protein. Med DMS footprinting vi starter på samme måde som i Dnase footprinting, ved udgangen af Navngivning af DNA og bindende protein. Then we methylate the DNA-protein complex with DMS, using a mild treatment so that on average only one methylation even occurs per DNA molecule. Så vi methylate DNA-protein kompleks med DMS, idet der anvendes en mild behandling, så den i gennemsnit kun en methylering selv opstår pr DNA-molekylet. Next, we dislodge the protein, and treat the DNA with a reagent that removes methylated purines, creating apurinic sites (deoxyriboses without bases) on the DNA. Dernæst skal vi fjerne de proteiner, og behandle DNA med et reagens, der fjerner denatureret purines, skabe apurinic lokaliteter (deoxyriboses uden baser) på DNA. Then we break the DNA at these apurinic sites. Så vil vi bryde DNA på disse apurinic websteder. These reactions are the same as the Maxam-Gilbert DNA sequencing reactions. Disse reaktioner er de samme som Maxam-Gilbert DNA-sekventering reaktioner. Finally we electrophorese the DNA fragments and autoradiograph the gel to detect the labeled DNA bands. Endelig vi Elektroforesér DNA-fragmenter og autoradiograph gelen til påvisning af mærket DNA båndene. Each band ends next to a nucleotide that was methylated and thus unprotected by the protein. Hver båndet slutter ved siden af et nukleotid, der blev denatureret og dermed ubeskyttede af protein.

See the DNA Molecule in 3-Dimensions Se DNA-molekyle i 3-Dimensioner

desoxyribonukleinsyre

Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | © 2005-2007 Molekylær Station.com, Alle rettigheder forbeholdt.

Send this page to a friend Send denne side til en ven

Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatik, protokollerne, DNA-RNA-Protein Proteomics