Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molekylær station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du er nødt til at registrere før du kan skrive indlæg på vores fora eller brug vores avancerede funktioner. Register Now! Tilmeld dig nu! Its Free and Fast! Dens frie og hurtigt!

Already registered? Allerede registreret? Login now below. Login nu nedenfor.

User Name: Bruger Navn:

Password:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Allerede registreret og Har du glemt dit password? Click below to recover it. Klik nedenfor for at genoprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Tilmeld dig nu - det er hurtigt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekylær Station er det største netværk af forskere, videnskabsmænd og videnskab kærester overalt!

Recent Forum Posts Nyt Forum Posts

DNA Protocols DNA-protokoller

DNA Encyclopedia DNA Encyclopedia

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatik

DNA Forum DNA-Forum

DNA Blog DNA Blog

DNA News DNA Nyheder

DNA Books DNA Bøger

DNA Footprinting DNA Footprinting

Copyright 2007 Molecular Station Copyright 2007 Molekylær Station

Background on DNA Footprinting Baggrund om DNA Footprinting

DNase footprinting is a molecular biology method that enables the detection of DNA-protein interactions by exploiting the property that a protein interacting with DNA will protect the DNA at that interaction site from restriction digestion or DNAase enzymatic cleavage. DNase footprinting er en molekylærbiologisk metode, der giver mulighed for sporing af DNA-protein interaktioner ved at udnytte ejendommen, at et protein interagere med DNA vil beskytte DNA på dette samspil websted fra restriktion fordøjelse eller DNAase enzymatisk spaltning. A DNA restriction fragment which contains the specific binding site is labeled at one end, usually with 32P and used for footprinting. En DNA-begrænsning fragment, der indeholder de specifikke bindende netsted er stemplet i den ene ende, sædvanligvis med 32P og anvendes til footprinting.

Protein and DNA are allowed to hybridize and bind together. Protein og DNA er tilladt at krydse sig og binder sammen.

DNA footprinting utilizes the enzyme DNase I or d eoxyribo n ucleic acid nucle ase I in order to digest or cut away free radiolabeled (or labelled) DNA leaving the protein bound DNA protected. DNA footprinting udnytter enzymet DNase I eller d eoxyribo n ucleic syre nucle ase jeg for at fordøje eller skæres væk gratis radioaktivt (eller mærket) DNA forlader proteinbundne DNA beskyttet. The DNA restriction fragments are treated lightly with DNase I, which makes single-strand breaks (nicks) in the DNA. Dna begrænsning fragmenter behandles let med DNase I, som gør én-strenget pauser (nicks) i DNA. A small amount of enzyme is used such that there is an average of less than 1 nick/strand. En lille mængde enzym, der bruges sådan, at der er et gennemsnit på mindre end 1 nick / indsatsområde. The reaction is then stopped, the DNA is denatured, and the mixture is run on a denaturing polyacrylamide sequencing gel. Reaktionen er så stoppet, DNA er denatureret, og blandingen er kørt på en denaturering polyacrylamid sekventering gel. These fragments separated by gel electrophoresis are exposed to detect the protected DNA area by analyzing the banding cleavage pattern on the gel. Disse fragmenter adskilles ved gelelektroforese er udsat til påvisning af DNA-beskyttede område ved at analysere banding cleavage mønster på gelen.

The cleavage pattern of the DNA in the absence of a DNA binding protein, typically referred to as free DNA, is compared to the cleavage pattern of DNA in the presence of a DNA binding protein. Den cleavage mønster af DNA i mangel af en DNA-bindende protein, typisk kaldet fri DNA, er sammenlignet med cleavage mønster af DNA i tilstedeværelse af en DNA-bindende protein. If the protein binds DNA, the binding site is protected from enzymatic cleavage. Hvis proteinet binder DNA, den bindende side er beskyttet af enzymatisk spaltning. This protection will result in a clear area on the gel which is referred to as the "footprint". Denne beskyttelse vil resultere i et klart område på gel, der er refereret til som "fodaftryk".

By varying the concentration of the DNA-binding protein, the binding affinity of the protein can be estimated according to the minimum concentration of protein at which a footprint is observed. Ved at variere koncentrationen af det DNA-bindende protein, den bindende affinitet af proteinet kan anslås ifølge den mindste koncentration af protein, hvor en fodaftryk er overholdt.

DNAse Footprinting Buffer Recipes DNAse Footprinting Buffer Opskrifter

DNase Footprinting Binding Buffer Recipe DNase Footprinting Bindende Buffer Recept

2X w/o KCl / For 10mls: 2X w / o KCl / For 10mls:

amount: [final] beløb: [endelig]
Tris-HCl pH7.6: 500 ul of 1M: 50 mM Tris-HCl pH7.6: 500 ul af 1M: 50 mM
MgCl2: 125ul of 1M: 12.5mM MgCl2: 125ul af 1M: 12.5mM
EDTA: 2 ul of 0.5M: 1mM EDTA: 2 ul af 0.5M: 1 mm
Glycerol: 2 mls: 20% Glycerol: 2 ml: 20%
DTT : 10 ul of 1M: 1 mM DTT: 10 ul af 1M: 1 mm

Binding Buffer (Gel Shift buffer) Bindende Buffer (Gel Shift buffer)

5X w/o KCL 5X w / o KCl
[final]: ingredient [endelig]: ingrediens
20%: gylerol 20%: gylerol
5mM: MgCl2 5mm: MgCl2
2.5mM: EDTA 2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT 2.5mM: DTT
250mM: NaCl 250: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5 50mm: Tris-HCl, pH 7,5
0.25mg/ml: poly (dI-dC) poly (dI-dC) 0.25mg/ml: poly (di-DC) poly (di-DC)

Ca/Mg Buffer Ca / Mg Buffer

For 10mls For 10mls
CaCl2: 50 ul of 1M: 5 mM CaCl2: 50 ul af 1M: 5 mm
MgCl2: 100 ul of 1M: 10 mM MgCl2: 100 ul af 1M: 10 mM

Loading Solution Loading Solution
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v) 0,1 M: NaOH: formamid (1:2 v / v)
0.1%: xylene cyanol 0,1%: xylen cyanol
0.1%: bromophenol blue 0,1%: bromophenol blå

Stop Buffer Stop Buffer
10mls
NaCl: 400 ul of 5M: 200 mM NaCl: 400 ul af 5M: 200 mM
EDTA: 600 ul of 0.5M: 30 mM EDTA: 600 ul af 0.5M: 30 mm
SDS: 1 ml 10%: 1% SDS: 1 ml 10%: 1%

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.) TEBe (tris-EDTA-beta mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6: 500 ul of 1 M: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6: 500 ul af 1 M: 50 mM
EDTA: 2ul of 0.5 M: 1 mM EDTA: 2ul på 0,5 M: 1 mm
Beta-mercaptoethanol: 10 ul : 15mM Beta-mercaptoethanol: 10 ul: 15mM

10 x K buffer 10 x K buffer
for 1 ml for 1 ml
Tris-HCl pH 7.5: 100 ul of 1 M: 100 mM Tris-HCl pH 7,5: 100 ul af 1 M: 100 mm
MgCl2: 100 ul of 1 M: 100mM MgCl2: 100 ul af 1 M: 100mm
DTT: 50 ul of 1M: 50 mM DTT: 50 ul af 1M: 50 mM
dH2O: 750 ul dH2O: 750 ul

DNAse Footprinting Protocol DNAse Footprinting protokol

The DNA used usually contains the binding site of your protein of interest. De DNA bruges normalt indeholder bindende site af dine proteiner af interesse. The DNA is purified, then digested with restriction fragments to be of an appopriate size. De DNA er renset, og derefter fordøjes med begrænsning fragmenter for at være af en appopriate størrelse. The DNA fragment is labeled on one end (binding site > 25 bp from end). De DNA-fragment er stemplet på den ene ende (bindende websted> 25 bp fra slutningen).

One strand labeling can be accomplised by: Et indsatsområde mærkningssoftware kan accomplised ved:

1. isolating the fragment with restriction enzyme(s) containing 5' overhang, labeling with Klenow and the appropriate hot nucleotide. isolere fragment med begrænsning enzym (r) indeholdende 5 'overhæng, med etikette med Klenow og passende varmt nukleotider. Then digest with an enzyme that removes one end. Så fordøje med et enzym, der fjerner den ene ende.
2. isolating a fragment digested with a restriction enzyme that creates 5' and 3' end, labeling with Klenow will only label the 5' overhang. isolere et fragment fordøjet med en begrænsning enzym, der skaber 5 'og 3' End, med etikette med Klenow kun vil mærke de 5 'overhæng.
3. As in "a" but with any enzyme and using polynucleotide kinase to label 3' end (kinase) and digesting off one of the ends with a second (third) restriction enzyme. Som i "a", men med nogen enzym og bruge polynukleotider kinase at mærke 3 'udgang (kinase) og fordøje ud for en af enderne med en anden (tredje) begrænsning enzym.
   (REMINDER: if labeling with Klenow, at the end of reaction add an excess of cold nucleotide of the same nucleotide that is labeled ( ie if you use dCTP32, add dCTP at the end) to make sure all ends are filled in equally. (Bemærk: hvis mærkningssoftware med Klenow ved udgangen af reaktionen tilføje et overskud af kulde nukleotid af samme nukleotider, som er mærket (dvs. hvis du bruger dCTP32, tilføje dCTP i slutningen) for at sikre alle ender er udfyldt, lige.

For Klenow fragments, 0.3ug bring up to 100 ul in TE, heat kill Klenow at 68 °C for 10 minutes. For Klenow fragmenter, 0.3ug indbringe op til 100 ul i TE, varme dræbe Klenow på 68 ° C i 10 minutter.

LABELING with one 5' overhang MÆRKNING med en 5 'overhæng

Sample RXN : 15 ng is need for each reaction. Prøve RXN: 15 ng er behov for hver reaktion. If making probe for many reactions JUST increase amount of DNA up to 300 ngs. Hvis der gør sonden for mange reaktioner JUST øge mængden af DNA op til 300 NGS.
15ng: DNA fragment 15ng: DNA-fragment
2 ul: 10x K buffer 2 ul: 10x K buffer
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul 5 ul: 32P dCTP 3,33 um 10 UCI / ul
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP 2 ul: 2mm @ DA, GD dTTP
1 ul: Klenow 1 ul: Klenow
20 ul Final volume, 37°C 30 min. 20 ul endelig volumen, 37 ° C 30 min.
--add 1 ul 10mM dNTP, 5 min @ 37°C . -- tilføj 1 ul 10mm dNTP, 5 min @ 37 ° C.

--add 80 ul TE. -- tilføj 80 ul TE. 68°C 15 minutes, put on ice. 68 ° C 15 minutter, lagt på is.
--G-50 Spin Column (spin at about 2000g) -- G-50 Spin Kolonne (spin på ca 2000g)
--ADD 1/10 vol 3M Na0Ac, 2.5 volumes EtOH, Ice 30 mins, (Optional if [DNA] is = or > 3 ng/ul you might post G-50 directly) Microfuge 30 minutes. -- ADD 1 / 10 vol 3M Na0Ac, 2,5 mængder EtOH, Ice 30 mins, (Valgfrit hvis [DNA] = eller> 3 ng / ul du måske Post G-50 direkte) mikrofugeglas 30 minutter.
--wash with 70% -- vask med 70%
--Dry Bring up in 5ul -- Tør Bring op i 5ul

Binding Reaction For DNase Footprinting Bindende Reaction For DNase Footprinting

Binding Reaction should have between 10 and 150mM KCl (more salt reduces binding but increases specificity). Bindende Reaction burde have mellem 10 og 150mm KCl (mere salt reducerer bindende, men øger specificitet). The typical concentration is 50mM. Den typiske koncentration er 50mm.

Protein DNA Binding: Protein DNA Indbinding:
25 ul of 2X Binding Buffer w/o KCl 25 ul af 2X Bindende Buffer w / o KCl
5ul of 3 ng/ul unilabeled DNA 5ul af 3 ng / ul unilabeled DNA
X ul of KCl to equal 10-150 mM KCl X ul kaliumchlorid til lige 10-150 mM KCl
dH20 to equal 50 ul minus volume for binding protien dH20 til lige 50 ul minus volumen for bindende protien
1-3 Footprinting Units of DNA binding protein (or 10 to 160 ug of Crude nuclear extract) 1-3 Footprinting Enheder af DNA-bindende protein (eller 10 til 160 ug af primitiv nuklear ekstrakt)

--mix gently, ice 10 minutes. -- blandes forsigtigt, is 10 minutter.

KEEP TIMING IN MIND, OPBEVARES TIMING I BETRAGTNING,
--ADD 50 ul of RT Ca/Mg solution, 18°C for 1 minute. -- Tilsæt 50 ul af registreringsafgiften Ca / Mg løsning, 18 ° C i 1 minut.
--ADD 3 ul dilute RQ1 DNase (0.05 u/ul diluted in Tris) INCUBATE 1 minute. -- ADD 3 ul fortyndet RQ1 DNase (0,05 u / ul fortyndet i Tris) Der inkuberes 1 minut.
--STOP addition of 90 with 37°C STOP solutions, -- STOP Ud af 90 med 37 ° C STOP løsninger,

--you should Phenol: CIA, and CIA extract, and Ethanol precipitate. -- du bør Phenol: CIA, og CIA-ekstrakt, og ethanol bundfald.
--RESUSPEND in 4ul of Loading Solution. -- Resuspender i 4ul af Loading Solution.
--Run on 5% standard Urea-DNA sequencing gel (consider wedge gel) with appopriate loading lanes such as DNA ladder, uncut DNA, and controls. -- Kør på 5% standard Urea-DNA-sekventering gel (overveje kile gel) med appopriate lastning baner, såsom DNA-stigen, uslebne DNA, og kontroller.

Analyze footprinting pattern. Analyser footprinting mønster.

Troubleshooting and Problems? Fejlfinding og problemer? See the DNAse Footprinting Forum! Se DNAse Footprinting Forum!

For problems and troubleshooting DNAase footprinting, post a new thread to discuss it in the DNA Footprinting Forum ! For problemer og fejlfinding DNAase footprinting, poste en ny tråd til at diskutere det i DNA Footprinting Forum!

Other DNA Protocols and Methods Andre DNA-protokoller og Metoder

DNA Cloning Guide DNA Kloning Guide

DNA Gel Electrophoresis DNA gelelektroforese

Restriction Enzyme Digestion - all you need to know ! Restriction Enzyme Fordøjelsesprocedure - alt du behøver at vide!

Genomic DNA Isolation Protocol Genomisk DNA Isolering protokol

Baceteria DNA Isolation Baceteria DNA Isolering

DNA Transformation - Contains History of DNA DNA Transformation - Indeholder History of DNA

Find other protocols at our DNA Protocols external resource directory or see our DNA protocols . Find andre protokoller på vores DNA protokoller ekstern ressource bibliotek eller se vores DNA-protokoller.

Related:

DNA Microarray Protocols DNA microarray protokoller

PCR Protocols PCR-protokoller

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatik

Visit DNA Bioinformatics . Besøg DNA bioinformatik.

DNA-Related News DNA-Related News

DNA News DNA Nyheder