Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

Bookmark Bookmark Site Záložka Záložka Site

Cell Transfection Buňka transfekce

This Transfection site is your portal for all things related to the transfection of cells with DNA plasmid or vector, RNA whether siRNA or RNAi, or even recombinant protein. Tento web je transfekce váš portál pro vše, co souvisí s transfekce buněk s DNA plasmidu nebo vektor, zda RNA siRNA nebo RNAi, nebo dokonce rekombinantní bílkoviny. We provide you with all the background information, protocols for cell transfection, optimization and analysis steps, and cell transfection troubleshooting information to become the ultimate expert! Snažíme se všemi podklady, protokoly o transfekce buněk, optimalizace a analýza kroků, transfekce buněk a informace o řešení problémů, aby se stala hlavním expertem!

Transfection Table of Contents Transfekce Obsah

• What is transfection? Co je transfekce?
• Background Pozadí
• Applications Aplikace
• Materials Materiály
• Transfection Methods Metody transfekce
• Buffers Buffery
  
• Preparation Příprava
• Protocol Protokol
• Other T ransfection Protocols Ostatní T ransfection protokoly
• Discussion Topics for Transfection Témata k diskusi transfekce
• Get Help on your Transfection Problems Získání nápovědy pro vaše transfekce Problémy
• Tips Tipy
• Storing Ukládání
• Troubleshooting In Transfection Poradce při potížích V transfekce
• References Odkazy

What is Transfection? Co je transfekce?

Transfection describes the introduction of foreign material into eukaryotic cells using a virus vector or other means of transfer. Transfekce popisuje zavedení cizího materiálu do eukaryontních buněk pomocí viru vektorové nebo jinými způsoby přenosu.

The term transfection for non-viral methods is most often used in reference to mammalian cells, while the term transformation is preferred to describe non-viral DNA transfer in bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae and plants. Termín transfekce pro ne-virovou metod je často používán v odkazu na savčích buňkách, zatímco období transformace, upřednostňuje při popisu non-virové DNA v přenosu bakterií a non-zvíře eukaryontní buňky jako houby, řasy a rostliny.

Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or 'holes' in the cell plasma membrane, to allow the uptake of material. Transfekce buněk obvykle vyžaduje otevření přechodné pórů nebo 'díry' na plazmatické membrány buněk, které umožní využití materiálu. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Genetického materiálu (například supercoiled DNA plasmidu nebo siRNA obrazce), nebo i proteiny, jako jsou protilátky, mohou být transfected. In addition to electroporation, transfection can be carried out by mixing a cationic lipid with the material to produce liposomes, which fuse with the cell plasma membrane and deposit their cargo inside. Kromě electroporation, transfekce může být prováděna míchání a kationtových lipidů s materiálem pro výrobu lipozomy, které pojistka s buněčnou membránou a plazmu uložit jejich nákladu uvnitř.

The original meaning of transfection was 'infection by transformation', ie introduction of DNA (or RNA) from a eukaryote virus or bacteriophage into cells, resulting in an infection. Původní význam transfekce byla 'infekce přeměnou', tj. zavedení DNA (nebo RNA) z Eukaryota virus nebo bakteriofág, do buněk, což vede k infekci. Because the term transformation had another sense in animal cell biology (a genetic change allowing long-term propagation in culture, or acquisition of properties typical of cancer cells), the term transfection acquired, for animal cells, its present meaning of a change in cell properties caused by introduction of DNA. Vzhledem k tomu, že období transformace ještě smysl v živočišné buněčné biologie (genetická úprava umožňující dlouhodobé-období rozmnožování v kultuře, nebo nabytí nemovitostí typický rakovinných buněk) se slova transfekce získal, na zvířecích buněk, jeho současné smyslu změny v buněčných vlastnosti způsobené zavedením DNA.

Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Transfekce je způsob, jakým experimentální DNA mohou být propuštěny do kultivované savčí buňky. Such experiments are usually performed using cloned DNA containing coding sequences and control regions (promoters, etc) in order to test whether the DNA will be expressed. Tyto pokusy jsou obvykle prováděny pomocí klonovaných DNA obsahující kódující sekvence a kontrolu regionech (stimulátory atd.), aby prověřil, zda se DNA se vyjádří. Since the cloned DNA may have been extensively modified (for example, protein binding sites on the promoter may have been altered or removed), transfection is often used to test whether a particular modification affects the function of a gene. Vzhledem k tomu, že klonované DNA může mít rozsáhle upraven (například vazba na bílkoviny na stránkách organizátora mohou být změněny nebo odstraněny), transfekce je často používán k testování, zda je konkrétní změna ovlivňuje funkci genu.

Transfection Diagram: Transfekce Graf:

Transfection Applications Transfekce Aplikace

The ability to synthesize RNA in the laboratory is critical to many techniques. Schopnost vyrobit syntézou RNA v laboratoři je kritický k mnoha technik. Radiolabeled and non-radiolabeled RNA probes are required for many protocols, and they can be synthesized easily in small scale in vitro transcription reactions allowing their use in blot hybridizations and nuclease protection assays. Radiolabeled a non-radiolabeled RNA sond jsou potřebné pro mnoho protokolů, a mohou být snadno syntetizovaných v malém měřítku, in vitro transkripce reakce umožňující jejich použití v vymaž hybridizations a nukleáza ochrany testy.

Requirements for Transfection? Požadavky pro transfekce?

• Vector or DNA Vektorové nebo DNA
• Cells Buňky
• Transfection Reagent Transfekce Reagent

Optimizing Transfection Optimalizace transfekce

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripce vyžaduje čištěný lineární DNA šablony obsahující promotor, ribonucleotide triphosphates, nárazník systém, který obsahuje DTT a hořčíku

Which Transfection Reagent to Use? Které transfekce činidlo používat?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripce vyžaduje čištěný lineární DNA šablony obsahující promotor, ribonucleotide triphosphates, nárazník systém, který obsahuje DTT a hořčíku

Transfection Methods Metody transfekce

There are various methods of introducing foreign DNA into a eukaryotic cell. Existují různé způsoby zavedení cizí DNA do eukaryontních buněk. Many materials have been used as carriers for transfection, which can be divided into three kinds: (cationic) polymers, liposomes and nanoparticles. Mnohé materiály byly používány jako nosiče pro transfekce, které lze rozdělit do tří typů: (kationtových) polymery, lipozomy a nanočástic.

One of the cheapest (and least reliable) methods is transfection by calcium phosphate, originally discovered by FL Graham and AJ van der Eb in 1973[citation needed] (see also [1]). Jedna z nejlevnějších (a nejméně spolehlivou) metod je transfekce o fosforečnan vápenatý, původně objevili FL Graham a AJ van der Eb v roce 1973 [citace nutná] (viz také [1]). HEPES-buffered saline solution (HeBS) containing phosphate ions is combined with a calcium chloride solution containing the DNA to be transfected. HEPES-pufrovaným fyziologickým roztokem (HeBS) s obsahem fosfátů iontů v kombinaci s roztokem chloridu vápenatého obsahující DNA, které mají být transfected. When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface. Když dva jsou kombinovány, pokutu sraženina z kladně nabitými vápníku a negativně nabité fosfát bude tvořit, vazba DNA transfected, aby se na jeho povrchu. The suspension of the precipitate is then added to the cells to be transfected (usually a cell culture grown in a monolayer). Pozastavení se sraženina se pak přidá do buněk, které mají být transfected (obvykle buněčné kultury pěstované v jednovrstvé). By a process not entirely understood, the cells take up some of the precipitate, and with it, the DNA. Do procesu nejsou zcela pochopeny, buňky převzít některé z sraženina, a s tím, že DNA.

Other methods use highly branched organic compounds, so-called dendrimers, to bind the DNA and get it into the cell. Jiné způsoby použití vysoce rozvětvený organické sloučeniny, tak-zvané dendrimers, zavazovat DNA a dostat ho do cely. A very efficient method is the inclusion of the DNA to be transfected in liposomes, ie small, membrane-bounded bodies that are in some ways similar to the structure of a cell and can actually fuse with the cell membrane, releasing the DNA into the cell. Velmi účinnou metodou je zapojení DNA transfected, které mají být v lipozomy, tj. malé, membránou ohraničené-subjekty, které jsou v některých bodech podobné struktury buňky a může skutečně pojistka s buněčnou membránou, kterým se DNA v buňce . For eukaryotic cells, lipid-cation based transfection is more typically used, because the cells are more sensitive. U eukaryontních buněk, tuků-kace je založena transfekce více typicky používají, protože buňky jsou citlivější.

Another method is the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethylenimine. Další metodou je použití kationtových polymerů jako DEAE-dextran nebo polyethylenimine. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis. Na negativně nabité DNA se váže na polycation a složité je převzat do buňky přes endocytosis.

A direct approach to transfection is the gene gun, where the DNA is coupled to a nanoparticle of an inert solid (commonly gold) which is then "shot" directly into the target cell's nucleus. Přímý přístup k transfekce je genové zbraň, kdy je DNA vázanou na nanoparticle na inertní pevné (obecně zlato), která je pak "výstřel" přímo do cílové buňky jádro. DNA can also be introduced into cells using viruses as a carrier. DNA může být rovněž zaveden do buněk pomocí virů jako dopravce. In such cases, the technique is called viral transduction, and, the cells are said to be transduced. V takových případech je technika se nazývá virová transdukce, a buňky se říká, že je transduced.

Other methods of transfection include nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection and proprietary transfection reagents such as Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene or DreamFect. Jiné metody zahrnují transfekce nucleofection, electroporation, tepelného šoku, magnetofection a vlastnické transfekce činidel jako Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene nebo DreamFect.

Stable vs Transient Transfection Methods Stabilní vs přechodových Metody transfekce

For most applications of transfection, it is sufficient if the transfected gene is only transiently expressed. Pro většinu aplikací na transfekce, stačí, je-li transfected genu je pouze přechodně vyjádřeny. Since the DNA introduced in the transfection process is usually not inserted into the nuclear genome, the foreign DNA is lost at the later stage when the cells undergo mitosis. Vzhledem k tomu, že DNA uvedl v transfekce proces je obvykle nejsou zařazeny do jaderného genomu, cizí DNA je ztracen v pozdější fázi, kdy buněk podstoupí mitóza. If it is desired that the transfected gene actually remains in the genome of the cell and its daughter cells, a stable transfection must occur. Pokud je žádoucí, aby transfected genu skutečně zůstává v genomu buňky a její dcera buněk, stabilní transfekce musí dojít.

To accomplish this, another gene is co-transfected, which gives the cell some selection advantage, such as resistance towards a certain toxin. V takovém případě jiného genu je co-transfected, který dává buňce výběr některých výhod, jako je odolnost vůči určitým toxinem. Some (very few) of the transfected cells will, by chance, have inserted the foreign genetic material into their genome. Některé (velmi málo) z transfected buněk bude tím, že šance, které znějí cizí genetický materiál do jejich genomu. If the toxin, towards which the co-transfected gene offers resistance, is then added to the cell culture, only those few cells with the foreign genes inserted into their genome will be able to proliferate, while other cells will die. Pokud se toxiny, na něž spoluúčast-transfected genu nabízí odpor, se pak přidá do buněčné kultury, jen těch několika málo buněk s cizími geny vložené do jejich genomu bude moci rozmnožovat, zatímco jiné buňky zemřou. After applying this selection pressure for some time, only the cells with a stable transfection remain and can be cultivated further. Po použití tohoto výběru tlak na určitou dobu, jen buňky s stabilní transfekce zůstávají a mohou být pěstovány další.

A common agent for stable transfection is Geneticin, also known as G418, which is a toxin that can be neutralized by the product of the neomycin resistant gene. Společný agent pro stabilní transfekce je Geneticin, známý také jako G418, který je toxin, který může být neutralizovaného, který výrobek z neomycin odolné genu.

Which Transfection Reagent or Method to Use? Které transfekce činidlo nebo metodu použít?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripce vyžaduje čištěný lineární DNA šablony obsahující promotor, ribonucleotide triphosphates, nárazník systém, který obsahuje DTT a hořčíku

Tips for Transfection Tipy pro transfekce

• Use RNAse inhibitors always! Pomocí RNAse inhibitory vždy!
• Saving Money with T7 RNA Phage Polymerase: Clones with an N-terminal His-6 tag are available. Ušetříte peníze s T7 RNA polymeráza Phage: Klony s N-terminální Jeho-6 štítkem jsou k dispozici. If you obtain this clone, you can purify large amounts of T7 polymerase with high activity (ref: He B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142–151). Pokud jste získali tento klon, můžete čistit velké množství T7 polymerázy s vysokou činnosti (ref: Je B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, WT McAllister, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• To remove the DNA template, use an RNAse-free DNAse. Chcete-li odstranit DNA šablony, používat RNAse-DNAse zdarma. We have used RQ1 DNase (Promega) added for 15 minutes and it works well. Jsme použili RQ1 DNase (Promega) zní po dobu 15 minut a funguje to dobře.

Storing Trasfection Reagent Ukládání Trasfection Reagent

• RNA is best stored at a neutral pH with EDTA. RNA je nejvhodnější skladovat na neutrální pH s EDTA.
• TE buffer is recommended (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), however this should be prepared with RNAse free purified (preferablly Millipore water). TE buffer je doporučeno (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), ale to by mělo být připraveno s RNAse zdarma čištěný (preferablly Millipore vody).

Troubleshooting Transfection Problems Poradce při potížích transfekce Problémy

Failed Transfections Nepodařilo Transfections

• Old transfection reagent Staré transfekce činidlo
• Improperly stored transfection agent Nesprávně skladovaných transfekce agent
• Poor quality DNA or vector Nekvalitní DNA nebo vektoru
• Insufficient DNA amount Nedostatečné DNA částka
• Insufficient transfection reagent Nedostatečné transfekce činidlo
• Too much DNA Příliš mnoho DNA
• Too much transfection reagent Příliš mnoho transfekce činidlo

References on Transfection Odkazy na transfekce

References on Transfection Odkazy na transfekce

1. Bacchetti S, Graham F (1977). Bacchetti S, Graham F (1977). "Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA". "Přenos genu pro thymidin kinázy k thymidin-kináza nedostatečné lidské buňky, které čištěný herpes simplex virové DNA". Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108. PMID 193108.