Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

RNA Protocols RNA protokoly

RNA Encyclopedia RNA Encyklopedie

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatika

RNA Forum RNA fórum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Novinky

Northern Blot Severní vymaž

Copyright 2007 - Molecular Station Copyright 2007 - molekulární stanice

AUDIO AUDIO Listen to a detailed Northern Blot Explanation ! Poslechněte si podrobný Severní vymaž vysvětlení!

History of Northern Blotting Historie Severní blotting

Northern blotting is an RNA blotting technique which was developed in 1977 by Alwine et al. Severní blotting je RNA blotting techniky, která byla vyvinuta v roce 1977 Alwine et al. at Stanford University (ref:1). na Stanford University (ref: 1). It was named after the Southern blot technique which blots for DNA, invented by Edwin M. Southern in 1975. Western blot , a method for blotting for proteins is also a play on the Southern blot naming and was named in 1981 (ref:2). Byl pojmenován po jižní vymaž techniky, která Blot na DNA, kterou vynalezl Edwin M. jižních v roce 1975. Western Blot, což je metoda pro blotting na bílkoviny, je také hra na jižní vymaž jmen a byl pojmenován v roce 1981 (ref.: 2) .

Background Information - Northern Blot Technique Základní informace - Severní blot Technika

Northern analysis despite its age in the high tech world of Real Time PCR, nuclease protection assays (RPAs) and microarrays, is still the gold-standard for the detection and quantitation of mRNA levels. Severní analýzy i přes své stáří v technicky vyspělých svět na Real Time PCR, nukleáza ochrany testy (RPAs) a microarrays, je stále ještě zlato-standard pro detekci a detekce na úrovni mRNA. This is because northern blot analysis allows a direct comparison of the messenger RNA abundance between samples on a single membrane. Je to proto, že severní vymaž analýza umožňuje přímé srovnání s RNA hojnost mezi vzorky v jediné membrány.

In northern blot the main difference between the other blotting techniques is that RNA is the factor being detected. V severní vymaž hlavní rozdíl mezi ostatními blotting techniky je, že RNA je faktor, že budou odhaleni. Also, due to the fact that RNA is usually single-stranded, it creates complex secondary structures which affect its migration and hence denaturing conditions are used to run the gels (unlike Southern). Také vzhledem ke skutečnosti, že RNA je obvykle jediné-ztroskotal, že vytváří složité sekundární struktury, které ovlivňují jeho migrace, a tedy i podmínky denaturace se používají ke spuštění gely (na rozdíl od jižní).

RNA is separated out by RNA gel electrophoresis (usually agarose gel electrophoresis), subsequent transfer to membrane, hybridization with probe, and finally detection. RNA je oddělit pomocí gelové elektroforézy RNA (obvykle agarózového gelu, elektroforéza), následné přemístění do membrány, hybridizace se sondou, a konečně v obraze.

Similarly to Southern blotting, the hybridization probes may be DNA or RNA in northern blotting. Podobně jako v jižních blotting se hybridizace sondy může být DNA nebo RNA v severních blotting.

A variant of the procedure known as the reverse northern blot was occasionally (although, infrequently) used. Varianta postup známý jako reverzní severní vymaž byl občas (i když vzácně) použít. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. V tomto postupu se substrátem nukleové kyseliny (která je upevněná na membránový) je souborem izolovaných fragmentů DNA a RNA sondy je vytažen z tkání a radioaktivně značeného.

The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Použití DNA microarrays, které mají přijít do široké využití v pozdních 1990s a začátkem 2000s je více má na opačný postup, v tom smyslu, že zahrnují použití izolovaných fragmentů DNA, připevněné k podkladu, a hybridizace se sondou vyrobené z buněčné RNA . Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled the one-at-a-time study of gene expression using northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored Tedy opačný postup, i když původně méně časté, umožnila jedno-v-a-time studium genové exprese pomocí severní analýzy se rozvinout v genové exprese profilování, v němž mnoho (možná všechny) z genů v organismu může mít jejich vyjádření sledovat

Applications of the Northern Blot Přihlášky na severní vymaž

Northern blots have been superceded in most areas by Real Time PCR and microarray approaches. Severní Blot byly superceded ve většině oblastí, které v reálném čase PCR a Microarray přístupy. It is not often used for clinical or diagnostic purposes. Nestává se často používají pro klinické a diagnostické účely.

The northern blot protocol and its variations are used however in molecular biology research to: Severní vymaž protokol a jeho variace jsou však používány v molekulární biologii se výzkumu:

• a gold-standard for the direct study of gene expression at the level of mRNA (messenger RNA transcripts). - zlatý standard pro přímé studium exprese genů na úrovni mRNA (RNA přepisy).
• detection of mRNA transcript size detekci mRNA přepis velikosti
• study RNA degradation Studie degradace RNA
• study RNA splicing - can detect alternatively spliced transcripts Studie RNA zatavovací - alternativně lze zjistit spojený přepisy
• study RNA half-life Studie-RNA poloviny života
• study IRES (internal ribosomal entry site) - to remove possibility of RNA digestion vs 2nd cistron translation. Studie IRES (vnitřní ribozomální vstupu site) - odstranit možnost trávení RNA vs 2. cistron překladu.
• often used to confirm and check transgenic / knockout mice (animals) často používají k potvrzení a kontrola transgenní / knockout mice (zvířat)

Disadvantages of Northern Blotting Nevýhody Severního blotting

The disadvantages of using northern blotting include: K nevýhodám použití severní blotting patří:

• Often radioactivity is used. Často se používá radioaktivity. This prevents ease of performing it, use and disposal. To brání snadné plnit to, využívání a odstraňování. New methods of non-radioactive detection have been generated allowing non-radioactive detection. Nové metody non-radioaktivní detekce byly generovány umožňuje non-radioaktivní detekci. See Pierce. Viz Pierce.
• The whole process of northern blotting takes a long time usually, from sample preparation through to detection. Celý proces na severní blotting trvá dlouho, obvykle od přípravy vzorku až po zjištění.
• If RNA samples are even slightly degraded by RNases, the quality of the data and quantitation of expression is quite negatively affected. Pokud RNA vzorků jsou dokonce i mírně degradované o RNases, kvalita dat a detekce projevu je velmi negativně ovlivněna.
• The standard northern blot method is relatively less sensitive than nuclease protection assays and RT-PCR. Standardní severní vymaž metoda je relativně méně citlivé než nukleáza ochrany testů a RT-PCR. The sensitivity of northern blots may be increased with the use of nylon positively-charged membranes, use of a highly specific antisense probe. Citlivost na severní Blot může být zvýšena za použití nylonové pozitivně-účtována membrány, použití vysoce specifických antisense sondou.
• Detection with multiple probes is a problem. Detekce s více sond je problém. Often, the membranes must be stripped before hybridization and detection with a second probe. Často se membrány musí být svlékl před hybridizace a detekce s druhou sondou. This is a problem as harsh conditions are required to strip off probes from the blot and is also time consuming. To je problém, jak drsné podmínky, aby se svléci sond z vymaž a je také časově náročná. Also, there is a limit to the amount of times a blot may be stripped. Také tam je limit pro částku, která občas kaňka může být svlékl.

Advantages of Northern Blotting Výhody Severní blotting

The advantages of northern blots include: Výhody severní Blot patří:

• It is a widely accepted and well regarded method Je všeobecně přijímáno a považováno i metoda
• northern blotting is a straight-forward method severní blotting je rovně vpřed-metoda
• Often it is used as a confirmation or check Často se používá jako potvrzení nebo šekem
• Often a gold-standard Často zlatý standard -
• it is a versatile protocol as it can allow the usage of many types of probes (vs Real time PCR) including: radiolabeled and non-radiolabeled, in vitro transcribed RNA and even oligonucleotides such as primers. to je univerzální protokol, protože může povolit použití mnoha typů sond (VS PCR v reálném čase), včetně: radiolabeled a non-radiolabeled, in vitro přepsaný RNA oligonucleotides a dokonce i jako základní nátěr.
• Sequences with even partial homology, unlike real time PCR or other methods can be used as hybridization probes (ie sequence from different species for homology analysis, or even genomic fragments can be used). Sekvence se i částečná homologie, na rozdíl od PCR v reálném čase nebo jiné metody mohou být použity jako hybridizace sondy (tj. sekvence z různých druhů homologie pro analýzu, nebo dokonce genocida fragmenty mohou být využity).

Northern Blot Protocol Severní vymaž protokolu

As mentioned the steps in northern blotting include: Jak bylo uvedeno kroky v severních blotting patří:

1. RNA isolation RNA izolace
2. Gel electrophoresis of RNA for separation Gelové elektroforézy na RNA pro separaci
3. Transfer to membrane (usually positively charged nylon as RNA is negatively charged) Převod do membránou (obvykle kladně nabitými nylon, jak RNA je negativně nabitá)
4. Cross-linking of RNA to membrane (usually by UV-crosslinking or chemical means) Cross-vazba RNA do membránou (obvykle pomocí UV-crosslinking nebo chemickými prostředky)
5. Hybridization Hybridizace
6. Detection Detekce

Materials Needed for Northern Blot Protocol Materiály potřebné pro Severní vymaž protokolu

Buffer Recipes Buffer Recepty

20XSSPE (500 ml) 20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl : 105.2 g 3.6M NaCl: 105,2 g
• 0. 2M phosphate buffer pH 7.0: 100mL of 1M 2M fosfátového pufru pH 7,0: 100 ml na 1M
• 20mM EDTA: 20mL of 0.5M 20mm EDTA: 20 ml na 0.5m

Phosphate buffer pH7.0 (500ml) Fosfátového pufru pH7.0 (500 ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL of 1M NaH2PO4 (monohydrát) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL of 1M Na2H2PO4 (Dibasic) 360 ml 1M
• pH to 7.0 after both are added pH 7,0 až poté, co obě jsou přidány

Hybridization buffer =HB (100mls) Hybridizační pufr = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10% 2% BL: 20 mls 10%

* *Right before using add 1000ug denatured RNAse free CT DNA (heat to 95o for 3 min to denature) 5000ug yeast RNA * * * * Přímo před použitím přidat 1000ug denaturovaného RNAse zdarma CT DNA (teplo do 95o za 3 min denaturovat) 5000ug droždí RNA

WASH: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS WASH: 2x SSPE + 0,1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% BL = 0,1% SDS

Running buffer for RNA gel (1L) Běžící vyrovnávací paměť pro RNA gelu (1L)

• 100 mls 10X MOPS 100 mls 10X MOPS
• 52. 6 mls of formaldehyde 6 mls formaldehydu
• 847. 4 mls H20 4 mls H20

RNA Gel (70ml) RNA Gel (70 ml)

• 0.84 g agarose 0,84 g agarózy
• 7 mls 10x MOPS 7 mls 10x MOPS
• 58.38 mls H2O 58,38 mls H2O
• Put gel in solution by heating. Dejte gel v řešení vytápění. Let gel cool to 60øC, then add Formaldehyde to equal 0.66M --3.78 mls Nechte gel vychladnout na 60 ø C, poté přidejte Formaldehyd na rovné 0.66M - 3,78 mls
• Pour gel in fume hood if possible Pour gel v dým kapuce je-li to možné

RNA Samples for Northern Blot Vzorky RNA pro Severní vymaž

See RNA Isolation and Purification Viz RNA izolace a čištění

RNA Gel RNA Gel

After isolating RNA, the RNA must be separated out on a gel (usually agarose). Po izolaci RNA, že RNA musí být odděleny na gelu (obvykle agarózy).

see RNA gels viz RNA gely

Northern Blot Transfer to Nylon Membrane Protocol Severní vymaž Převod do Nylon Membránové protokolu

After running the RNA gel , wash the gel with distilled water put on posiblotter. Po spuštění RNA gel, promytí gelu s destilovanou vodou kladen na posiblotter.

Layers from top to bottom are: Vrstvy odshora až dolů, jsou:

• sponge houba
• 3-4 Whatman papers cut to size ( both of these up above should be soaked in 10X SSPE but not dripping) 3-4 Whatman papíry řezané na určitý rozměr (v obou těchto do výše by měla být ponořen v SSPE 10X ale ne odkapávání)
• gel mask. gelové masce.
• Note: Make sure the gel overlays the mask so that it can seal membrane with line of the top of gel and the right top corner marked 3 pieces slightly bigger 3M paper hard plastic with holes Poznámka: Ujistěte se, že gel překryvy masku tak, aby mohl pečeť membránou s linií horní části gelu a pravém horním rohu označeny 3 kusy mírně větší 3M papíru tvrdého plastu s otvory

Clamp on and make sure there is a good seal. Připevnit a ujistěte se, že je dobré pečeť. Use 75-80 mm Hg of pressure for 1 hr or more. Pomocí 75-80 mm Hg tlaku po dobu 1 hod. a více.

Blot membrane dry Vymaž membránové suché

Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot Protocol Cross-spojující Nylon Membrány - Severní vymaž protokolu

• Cut top right corner wrap in saran wrap. Řezané horním rohu zábal v SARAN zábal.
• UV irradiate with RNA side down for 2.5 min. UV ozářit RNA stranou směrem dolů na 2,5 min.
• Wash for a couple of minutes in hot 2X SSPE/0.1% SDS solution (Microwave solution for 30-45 seconds at 50% power. Umyjte si na pár minut v horké 2X SSPE/0.1% roztoku SDS (mikrovlnné řešení na 30-45 sekund na 50% výkonu motoru.
• Air dry Suchý vzduch

Pre Hybridization for Northern Blot Pre hybridizační pro Severní vymaž

1. Pre Hybridize for 6 hours-overnight Pre křížit po dobu 6 hodin-jednodenní
2. Set oven to 65øC heat HB buffer to put SDS in solution Nastavit troubě na 65 ø C tepla HB vyrovnávací paměti, aby BL v roztoku
3. Roll up membrane inside piece of mesh and put into hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS) Natáčet membrána uvnitř kus oka a do hybridizaton trubice (2X SSPE/0.1% SDS)
4. Check for air bubbles Odbavení na vzduchové bubliny
5. Put tube in oven balanced with another tube on opposite side Vložte zkumavku v troubě vyvážené s jiným trubice na opačné straně

Labeling probe for Northern Blotting Labeling sondy pro Severní blotting

1. Put 25ng of probe in a total volume of 11uL with ddH2O Dejte 25ng sondy v celkovém objemu 11uL s ddH2O
2. Denature @ 95øC 3 min. Denaturovat @ 95 ø C 3 min. This is to get the probe single stranded and remove secondary structure which would prevent efficient hybridization. To je získat sondy jediné zdržení a odstranění sekundární konstrukce, které by bránilo účinné hybridizace.
3. Quick cool on wet ice. Rychlé vychladnout na mokrý led. This is to keep the probe single stranded, free of secondary structure and not allow reannealing (or reforming of secondary structures). To je udržet sondy jediné zdržení, bez sekundární struktury a neumožňuje reannealing (nebo reformu sekundárních struktur).
4. Add 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul total Přidat 4ul vysoké Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alfa radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul celkem
5. Incubate 10-15 min 37øC Inkubovat 10-15 min 37 ø C
6. Add 28uL of 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, to 20ul reaction. Přidat 28uL 1X TE, 2ul 0.5m EDTA, aby 20ul reakci.
7. Pre-spin G-25 Sephadex column for 1 minute. Pre-spinu G-25 Sephadex sloupce po dobu 1 minuty.
8. Add 50ul sample to column and spin for 2.5 min in clinical centrifuge. Přidat 50ul vzorku do kolony a spinu na 2,5 min v klinické centrifug. This is to purify probe away from label. To je pro čištění sondy od etiketě.
9. Throw away column. Zahodit sloupci.
10. Mix in a new tube 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA in a 0.5mL tube. Mix v novém trubice 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA v 0,5 ml zkumavce.
11. Denature 95ø 3 min Denaturovat 95 ø 3 min
12. Add to hybrid tube mix, hybridize at 65øC for 20-36 hrs Přidat do zkumavky hybridní kombinace, křížit v 65 ø C po dobu 20-36 hodin

Post hybridization Protocol for Northern Blotting Post hybridizace protokolu pro Severní blotting

Hybridize for 36-48 hours then wash. Křížit za 36-48 hodin, potom umýt.

1. Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (wash) heat up to 65ø C (Use microwave or water bath to warm solution) Ohřát 2X SSPE/0.1% SDS (prádla) ohřát na 65 ø C (Použití mikrovlnné troubě nebo vodní lázni do horkého roztoku)
2. Take out tube and pour liquid into hot radioactive waste container. Vytáhněte trubici a nalije kapalina do horkých radioaktivních odpadů kontejneru.
3. Rinse with 10ml wash do this twice and pour waste out. Opláchněte s 10 ml promývací to udělat dvakrát a nalít odpadů ven.
4. Put in 40 to 50 mls of wash and shake vigoursly. Dejte ve 40 až 50 mls prádla a shake vigoursly.
5. Put in hybridization oven for 20 min rotating. Dej v hybridizační peci po dobu 20 minut otáčí.
6. Pour down sink Pour se dřezem
7. Another 40-50mls and shake in oven. Dalších 40-50mls a otřesu v troubě.
8. Pour out to waste container (sink if not hot or toxic) and make sure it is no longer hot and then take out membrane. Vylil do nádoby na odpad (dřez, ne-li za tepla nebo toxické) a ujistěte se, že je již teplé a pak nechat membránou.
9. Wash on shaker with 0.2XSSPE w/ 0.1% SDS at RT for 15 min. Mycí na třepačce s 0.2XSSPE w / 0,1% SDS v RT po dobu 15 min.
10. Air dry Suchý vzduch
11. Expose Vystavujeme

Tips for Northern Blot Tipy pro Severní vymaž

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Pokud máte v současnosti preferovaný způsob pro izolaci RNA, nadále používat.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Vždy spustit agarózového gelu na vaše RNA pro posouzení kvality. Do not only rely on spectrophotometry results. Nenechte si jen spoléhat na spektrofotometrie výsledky.

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Používejte ošetřené DEPC vodě a pečené sklo. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Toto řešení, naprosto pozitivně, musí být Rnase zdarma. Rnase is everywhere! Rnase je všude! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Nosit rukavice, použití jen pečené sklo, nebo panenských plastů. DePC treat your water, buffers (except Tris). DePC léčit vaše voda, pufry (kromě Tris). Be very careful. Buďte velice opatrní.

Troubleshooting Northern Blots Poradce při potížích Severní Blot

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Pokud máte v současnosti preferovaný způsob pro izolaci RNA, nadále používat.

Discuss and post questions about this in the Northern Blot Forum . Projednat a po otázky týkající se tohoto v Severní vymaž fóra.

Northern Blot References Severní vymaž Odkazy

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". "Metoda pro detekci specifické RNAs v agarózovém gely převodem na diazobenzyloxymethyl-papír a hybridizace s DNA sond". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (12): 5350-4. USA 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). W. Neal Burnette (duben 1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". " 'Západní blotting': elektroforetickými přenos bílkovin z sodný dodecyl sulfát - polyakrylamidovém gely na neupraveném nitrocelulózy a detekce rentgenovým snímkem s protilátkou a radioiodinated bílkovin A". Anal Biochem 112 (2): 195-203. Anal Biochem 112 (2): 195-203.