Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

Bookmark Bookmark Site Záložka Záložka Site

Real-time PCR Real-time PCR

Real time and Quantitative PCR Reálném čase a kvantitativní PCR

Introduction to Real-Time PCR Úvod do Real-Time PCR

Real-time PCR is a type of quantitative PCR which measures the amount of cDNA or mRNA in a sample, either from a population of cells (tissue or cell culture), or recently even from a single cell.˙Real-time is used commonly to determine the expression of a gene's mRNA, and its expression levels (copy number of mRNA) during certain conditions (such as treating cells with a drug).˙ Real-time PCR can be used to compare normal (control) samples to disease samples, giving an idea as to expression changes which occur with pathogenesis.˙ Real-time PCR due to its sensitivity is also used in the detection of pathogens in the blood such as viruses. Real-time PCR je druh kvantitativní PCR, kterým se měří množství cDNA nebo mRNA ve vzorku, a to buď z populace buněk (tkání nebo buněčné kultury), nebo v poslední době dokonce z jediné buňky. Real-time se používá běžně na určení exprese genu na mRNA, a jeho vyjádření úrovně (číslo výtisku mRNA), během určitých podmínek (např. v léčbě buňky s drogami). Real-time PCR může být použita pro srovnání normální (kontrolní) vzorky k onemocnění vzorků, přičemž představu, jak k vyjádření změny, které se vyskytují patogeneze. Real-time PCR s ohledem na jeho citlivost je rovněž používán při detekci patogenů v krvi, jako jsou viry.

The development of real-time quantitative PCR has eliminated the variability traditionally associated with quantitative PCR, thus allowing the Vývoj real-time kvantitativní PCR odstranil variabilita tradičně spojená s kvantitativní PCR, což umožňuje
routine and reliable quantitation of PCR products. rutinní a spolehlivá detekce produktů PCR.

Table of Contents Obsah

Introduction to Real-time PCR Úvod do Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Výhody Real-time PCR

History of Real-Time PCR Historie Real-Time PCR

Real-time PCR systems Available Real-time PCR k dispozici systémy

Real-time PCR Protocols Real-time PCR protokolů

Mechanism of Real-time PCR Mechanismus Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: Výhody Real-time PCR

Each cell type expressess a set of mRNA molecules, known as a transcriptome.˙ In response to stimuli, cells are able to up-regulate or down-regulate factors such as protein enzymes inside the cell by regulating the mRNA levels of these factors.˙ mRNA levels are not always correlated with protein levels so some caution is necessary, however generally mRNA levels do loosely correspond to protein levels.˙ Measuring the mRNA levels of certain factors inside a cell using real-time pcr is a method which will give clues as to the amounts of these factors or proteins. Každá buňka typu expressess souboru mRNA molekuly, známé jako transcriptome. V reakci na podněty, buňky jsou schopny nahoru-dolů-regulaci nebo regulaci faktorů, jako jsou bílkoviny enzymů uvnitř buňky, o regulaci hladiny mRNA na tyto faktory. Hladiny mRNA jsou ne vždy souvisí s úrovní bílkovin takže některé opatrnost je nutná, nicméně obecně mRNA úrovni dělat volně, odpovídají úrovni proteinů. Měření hladiny mRNA některých faktorů uvnitř buněk pomocí real-time PCR je metodou, která bude obsahovat vodítka ohledně částky, těchto faktorů, nebo proteiny.

Traditionally, mRNA levels inside the cell were measured using Northern blotting.˙ This technique is regarded as a gold-standard in the measurement of gene expression/mRNA levels as it uses radiolabeled probe to label the RNA, which is then quantified using a scintillation counter giving very accurate readings. Tradičně, mRNA úrovních uvnitř buněk byly měřeny pomocí Severní blotting. Tato technologie je považována za zlatý standard-v měření genové exprese / mRNA úrovni, protože používá radiolabeled sondy na etiketě RNA, která se pak kvantifikovány pomocí scintilační čítač poskytující velmi přesné čtení. Northern blotting although very accurate had several disadvantages including the use of radioactivity. Severní blotting, přestože velmi přesné měl několik nevýhod, včetně využití radioaktivity. Northern blotting required the accurate measurement of mRNA and total RNA from cells extracted in order to compare samples. Severní blotting vyžadoval přesné měření na mRNA a celkovou RNA z buňky extrahované za účelem porovnání vzorků. This was a problem because although detection methods were very accurate, error could be introduced into Northern blotting (or RNA dot/slot blotting) through differences in total RNA/mRNA levels between samples (ie cell treatments, different tissues, different animals, etc.).˙ It also required relatively large amounts of RNA which required large numbers of cells. To byl problém, protože i když detekční metody byly velmi přesné, chyba by mohla být zavedena do Severní blotting (nebo RNA dot / slot blotting) přes rozdíly v celkové RNA / mRNA úrovni mezi vzorky (tj. buněk léčby, různých tkání, různých zvířat, atd. ). Je také zapotřebí relativně velké množství RNA, které vyžadují velký počet buněk. Recently, mRNA gene quantification or real-time pcr methods have been improved and are easier to perform and do not require the use of radioactivity.˙ Researchers often only have access to small amounts of cells especially in the fields of stem cell research and primary cell research, and real-time pcr has made it possible to quantify mRNA levels from even very small numbers of cells and lately even single cells.˙ However, this extreme sensitivity of real-time pcr methods makes it vital to protect one's samples from contamination, which would lead to false results. V poslední době se kvantifikace mRNA genu nebo real-time PCR metody byly lepší a snadnější provést a nevyžadují použití radioaktivity. Výzkumní pracovníci často dostanou malé množství buněk, zejména v oblasti výzkumu kmenových buněk a buněk primární výzkum , A real-time PCR bylo možné vyčíslit mRNA z úrovně i velmi malé množství buněk a poslední dobou i jediné buňky. Nicméně, tento extrémní citlivost na real-time PCR metody je důležité chránit své vzorky před kontaminací, která by vést k falešným výsledkům. Current real-time pcr methods and systems also do not require the measurement of mRNA or cDNA sample concentrations before real-time pcr is conducted. Aktuální real-time PCR metod a systémů, také nevyžadují měření mRNA nebo cDNA koncentrací vzorku před real-time PCR probíhá.

History of Real-Time PCR Historie Real-Time PCR

Higuchi et al.1,2 pioneered the analysis of PCR kinetics by constructing a system that detects PCR products as Higuchi et al.1, 2 průkopníkem analýzu PCR kinetiky o vybudování systému, který zjistí PCR produktů jako
they accumulate. se hromadí. This “real-time” system includes the intercalator ethidium bromide in each amplification reaction, Tento "real-time" systém zahrnuje intercalator etidiumbromidem v každém zesílení reakce,
an adapted thermal cycler to irradiate the samples with ultraviolet light, and detection of the resulting fluorescence o přizpůsobit tepelným cycler na ozářit vzorků s ultrafialovým světlem, a zjištění výsledná fluorescence
with a computer-controlled cooled CCD camera. s počítačem řízené-chlazený CCD kamerou. Amplification produces increasing amounts of double-stranded Amplifikace produkuje rostoucí množství double-uvízlých
DNA, which binds ethidium bromide, resulting in an increase in fluorescence. DNA, která se váže ethidiumbromidem, což vede ke zvýšení fluorescence. By plotting the increase in fluorescence O spiknutí zvýšení fluorescence
versus cycle number, the system produces amplification plots that provide a more complete picture of the versus cyklus číslo, systém produkuje zesílení pozemků, které poskytují úplnější obraz o
PCR process than assaying product accumulation after a fixed number of cycles. PCR procesu než assaying produktu hromadění po stanovený počet cyklů.

External sites: see Real Time PCR at Real Time PCR Info! Externích stránek: viz Real Time PCR v reálném čase PCR Info!

References for Real-Time PCR Odkazy na Real-Time PCR

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, and Griffith, R. 1992. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, a Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Simultánní amplifikace a detekce specifických sekvencí DNA.
Biotechnology 10:413–417. Biotechnologie 10:413-417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., a Watson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Kinetic PCR: v reálném čase sledování amplifikace DNA reakce.
Biotechnology 11:1026–1030. Biotechnologie 11:1026-1030.

Real-Time PCR Protocols Real-Time PCR protokolů	Real-Time PCR Bioinformatics and Databases Real-Time PCR Bioinformatika a databáze	Learn about Real-Time PCR Získejte informace o Real-Time PCR	Real-Time PCR Kits and Products Real-Time PCR sady a produkty	Real-Time PCR Forum Real-Time PCR fórum	Real-Time PCR Books Real-Time PCR Knihy