home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php home> bílkoviny> řešení potíží-západní-Blot> index.php
 |
|---|
The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! Molekulární stanice Průvodce do západní blotting problémy a jejich řešení: Společný Western Blot Problémy a řešení pro ně!
Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Kontaktujte nás prosím s Vašimi nápady, pokud můžete přidat do této příručce.
Membrane is Glowing in the Dark Room Membrána je Svítící ve tmě pokoje
Too many Bands in Western Blot Příliš mnoho Kapely v Western Blot
Troubleshooting Western Blots Problem: Poradce při potížích Western Blot Problém:
Spots on Film (missing bands) : Spoty na filmu (chybí pásky):
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Špatné přenosů díky vzduchové bubliny během přenosu na membránu
- dirty film when adding to the developer -- Špinavý film, když se k vývojář
- developer rolls are dirty -- Developer rolích jsou špinavé
Solution to spots on film: Řešení spoty na film:
- use a pasteur pipette as a roller. -- Použít pasteur pipety jako váleček. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. rolka membránový a gel před převodem odstranit bubliny. keep membrane and materials wet. zachovat membránový a materiálů za mokra.
- keep film clean before adding to the developer -- Zachovat filmu čisté před přidáním do vývojář
Troubleshooting Western Blots Problem: Poradce při potížích Western Blot Problém:
Too Many Bands in Western Blot : Příliš mnoho Kapely v Western Blot:
- usually due to many non-specific bands -- Obvykle v důsledku mnoha non-specifických pásmech
- poor primary antibody quality or old antibody -- Špatná kvalita primární protilátky nebo staré protilátky
- not enough blocking -- Nestačí blokování
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytické štěpení antigenu - všechny další kapely jsou nižší, než vaše MW proteinu, (tj. vaše bílkovin je detekován, ale byl degradovan)
Solutions to too many bands on western blot: Řešení příliš mnoho kapel na Western Blot:
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Nákup jiného protilátky nebo nahradit novou populaci protilátky
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Blok s 5% suché non-mléko nebo BSA před přidáním primární. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Pokud jste již blokace, zvažte, blokování během primární a sekundární protilátky incubations a také zvyšující se blokování mléka nebo BSA spojení.
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Zachovat všechno na led, použijte čerstvé vzorky, ukládat v - 80C, a použití inhibitorů proteázy, jako jsou PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: Poradce při potížích Western Blot Problém:
High background; low signal to noise ratio on Western Blot Vysoké pozadí; nízký poměr signálu k šumu na Western Blot
- black or every dark film; film was exposed too long -- Černé nebo tmavě každý film, film byl vystaven příliš dlouho
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blokace byla nedostatečná; non-specifické vazby primární protilátky a sekundární protilátky byly zcela neprané
- washing was insufficient -- Mytí byla nedostatečná
- film glows in dark! -- Film svítí ve tmě! - too high secondary or primary dilutions -- Příliš vysoká sekundární nebo primární ředění
Solutions to Dark Film: Řešení Dark Film:
- expose for less time, decrease exposure time -- Vystavit na kratší dobu, snížit expoziční čas
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Zvýšení blokování trvání ne-tuk sušené mléko 5% inkubace nebo zvýšení koncentrace.
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Rovněž můžete zkusit blokování s celou sérum na hostitelské zvíře s (nebo dříve) se sekundární protilátkou
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Zvýšení mytí časy a objemy, aby pomohla odstranit veškeré nedodržování-konkrétní signál kvůli slabé protilátky závazné.
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Použití silnějšího mycího umýt - Místo TBST (Tween-20), použijte silnější mycí prostředky, jako je NP-40 nebo BL, které mohou poskytnout přísnější umýt a snížení pozadí (to pouze v případě, že kapela je silná! - Mytí také odstraňuje některé vaše kapela na úroky!)
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Velmi vysoká sekundární protilátky (nebo dokonce primární) spojení - provést optimalizaci experimentů k určení správné ředění protilátky. dilute the antibodies further. ředění protilátky další.
Troubleshooting Western Blots Problem: Poradce při potížích Western Blot Problém:
Low Signal or Weak Signal Nízké signálu nebo slabý signál
- due to not enough protein loaded on the gel -- Vzhledem k ne dost bílkovin nahraje na gel
- primary antibody is old or not good -- Primární protilátka je starý nebo nebude dobré
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Fosfo-bílkoviny obvykle potřebují přes noc primární protilátky inkubace
- not enough secondary antibody -- Nestačí sekundární protilátky
- over-blocking -- Více než-blocking
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Rozvoj činidla jsou špatné / jste udělali chybu, když je připravuje
Solutions to Low Signal or Weak Signal : Řešení nízkého signálu nebo slabý signál:
- load more protein sample onto gel -- Zatížení více bílkovin vzorku do gelu
- try fresh primary antibody -- Zkuste čerstvé primární protilátky
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Inkubujte primární protilátky overnite pro phosphoproteins při 4 ø C (chladírny třepačce)
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Zvýšení koncentrace proteinu (štěpit se vzorky v méně lysis buffer)
- decrease concentration of blocking agent -- Pokles koncentrace blokování agent
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Zkontrolovat rozvojových činidel; připravit čerstvé ECL a ECL-zpětný membránový
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Zvýšení koncentrace nebo délky primární protilátky inkubační doba
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Zvýšení koncentrace nebo délka sekundární protilátky inkubační doba
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy kapely, Kapely zamazaný, Kapely není Sharp
- bands smeared due to hot gel -- Kapely zamazaný kvůli teplé gel
- bands fuzzy due to high voltage -- Kapely fuzzy kvůli vysoké napětí
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Řešení Fuzzy kapel a Un-ostré Kapely:
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Pokles napětí nebo proudu, spustí ve studené místnosti, a připravit nový běží vyrovnávací paměť. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Teplo způsobuje, že gel ztratit své tuhosti a jeho řešení silou)
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-namočit převodu membrány ve vhodném řešení převodu (určeno membránový výrobce) na požadovanou dobu.
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Podmínky poskytování služeb | Ochrana soukromí | © 2005-2007 molekulární Station.com, Všechna práva vyhrazena.
Send this page to a friend Pošlete tuto stránku svému příteli
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
