home > protein > immunoprecipitation-protocol > index.php home> bílkoviny> immunoprecipitation-protocol> index.php
 |
|---|
Immunoprecipitation and protocols. Immunoprecipitation a protokoly.
1. Treat your cells Dopřejte své buňky
2. Harvest cells by adding 500 uL of solubilizing buffer, scrape and pass through syringe a 21-gauge needle X5 times to homogenize. Sklizeň buněk přidáním 500 uL na solubilizing buffer, seškrábat a projít injekční stříkačky 21-měřidla jehly X5, až se zhomogenizuje.
3. Conduct a TCA precipitation (this will be used to normalize if you radiolabeled the cells eg with S-35) Uskutečnit TCA srážek (bude se používat k normalizovat když radiolabeled buněk např. u S-35)
4. Pre-clearing: Pre-clear by adding 2 uL of X, mouse or rabbit or goat serum ( where X is the animal species in which the primary antibody was raised ) to whole samples and incubate in a rotator for 30 minutes at room temperature. Pre-zúčtování: Pre-jasné přidáním 2 uL X, myš nebo králíků nebo kozí sérum (kde X je daný druh zvířat, v níž primární protilátky byla vznesena) na celé vzorků a inkubovat ve kroužit po dobu 30 minut při pokojové teplotě.
5. Remove X serum by incubating with 30 uL immunoprecipitin with 30 minutes rotation at room temperature. Odstranit X séra se inkubují 30 uL immunoprecipitin s rotací 30 minut při pokojové teplotě.
6. Centrifuge samples for 3 minutes at 13, 000 rpm. Centrifug vzorky po dobu 3 minut při 13, 000 ot. / min.
7. After centrifugation, add 5 uL of primary antibody ( X anti-Y specific protein, where Y is the antibody raised in an animal for your protein of interest) to the supernatants and incubate overnight at 4 degrees C. Po odstředění, přidat 5 uL primární protilátky (anti-X Y specifické bílkoviny, kde Y je protilátky vzneseny v živočišných bílkovin pro vaše úroku) na supernatants a inkubujte přes noc při teplotě 4 ø C.
8. Add 100 uL of immunoprecipitin to samples. Přidá se 100 uL na immunoprecipitin na vzorky. Alternatively you can use Zysorbin (Invitrogen). Případně můžete použít Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin requires some minor changes to the protocol) (Zysorbin vyžaduje určité drobné změny v protokolu)
9. Centrifuge at 13, 000 rpm for 3 minutes. Odstřeďujte na 13, 000 ot. / min po dobu 3 minut. Remove the supernatant. Odstraňte supernatant.
10. Wash pellet 3 X with 1 mL of cold IP wash buffer (add protease inhibitors to wah buffer prior to use) with shaking for 5-10 minutes between each wash. Mycí pelety 3 X s 1 ml studené IP promývací pufr (přidat inhibitory proteázy k wah bufferu před použitím) se třást na 5-10 minut mezi po sobě umýt.
11. Use this pellet to run on a SDS-PAGE gel. Pomocí tohoto pelety běžel v SDS-PAGE gelu. You can add SDS Sample Buffer (protein loading buffer) to this and load on gel directly after boiling. Můžete přidat SDS Ukázka vyrovnávací paměť (bílkoviny načítání vyrovnávací paměti) na tento náklad a na gelu přímo po varu.
©2005 Molecularstation.com © 2005 Molecularstation.com
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Podmínky poskytování služeb | Ochrana soukromí | © 2005-2007 molekulární Station.com, Všechna práva vyhrazena.
Send this page to a friend Pošlete tuto stránku svému příteli
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
