Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatika, protokoly, DNA, RNA bílkovin Proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologie Home protokoly bioinformačních nástrojů biologie Fórum molekulární biologie Encyclopaedia molekulární biologie Obrázky Přidat k oblíbeným!

home > protein-microarrays > protein-chip-detection > index.php home> protein-microarrays> protein-čip-detekce> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molekulární biologie Domů Věda Sport Věda Video DNA, RNA bílkovin Proteomics výzkum BETA! Bioinformatika Lab Vybavení molekulární biologie Techniky molekulární biologie Produkty a služby související Biologie Odkazy

Molecular Biology Blog Molekulární biologie Blog

Send this page to a friend Pošlete tuto stránku svému příteli

Intracellular Stations Intracelulární stanic

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Protilátka botaniky společného Vymazat Vymazat Alphabetic Knihkupectví buněčné biologie a kulturu gel Elektroforeza histologie Microarrays imunologie Mass Spectrometry mikrobiologie Molekulární Imaging peptid Proteomics Bílkoviny Microarray Chips PCR, Real-Time PCR a siRNA RNAi Stonek Buňka Biologie transfekce Western Blot

Protein Array Protocols Protein Array protokoly	Protein Array Bioinformatics Protein Array Bioinformatika	Learn about Protein Arrays Získejte informace o Protein Arrays	Protein Array Kits and Products Protein Array sady a produkty	Protein Array Forum Protein Array fórum	Proteomic News Proteomická Novinky

Protein Microarray Detection Methods and Analysis Bílkoviny Microarray metod a analýza

Protein and Antibody Microarrays Bílkoviny a Antibody Microarrays

Detection Methods and Analysis for Protein and Antibody Chips Metody detekce a analýzy pro bílkovin a Antibody Chips

Detection Methods and Non-specific Binding Metody detekce a Non-vazby
Non-specific binding to the array needs to be minimized and this is typically done by immersing the arrays in a bovine serum albumin based buffer (BSA) (31). Non-konkrétní vazbou na pole musí být sníženo na minimum a je to typicky provádí ponořením na pole v bovinní sérum albumin založen vyrovnávací paměti (BSA) (31).
Analyte-binding and retention on protein arrays proceeds via thermodynamically driven binding mechanism similar to the hybridization of nucleic acid targets to probes.ÿ However, the detection of bound targets to proteins is considerably more complex than that of DNA microarray detection (9).ÿ Currently a variety of detection methods are being examined.ÿ For example, ELISA was first used to detect proteins for both filter arrays (66,67) and glass arrays (68). Analyt-vázání a uchovávání na bílkoviny pole výtěžek přes termodynamicky řízený závazný mechanismus podobný tomu, který hybridizace nukleové kyseliny k cíli sondy. Nicméně zjištění cíle vázané na bílkoviny je podstatně složitější, než na DNA Microarray detekce (9). Nyní různých detekčních metod se zkoumají. Například ELISA byla poprvé použita k detekci proteinů pro oba filtrační pole (66,67) a sklo pole (68). ÿELISA based detection methods have the disadvantage of non-specificity of protein-antibody interactions, leading to many false positives.ÿÿ Radioisotope labeling was used by Ge et al. (22), radioisotope labeling to study protein–protein, protein–DNA, protein–drug interactions on filter arrays.ÿ Zhu et al. used radioisotope labeling to conduct kinase assays of different substrates by using purified yeast kinase proteins on a array (36).ÿ The preferred method of detection is fluorescence detection because these methods are generally safe, extremely sensitive, simple and can have very high resolution.ÿ These detection methods are also compatible with standard microarray scanners. ELISA metody detekce založená mají nevýhodu, že ne-specifičnost interakce protein-protilátka, což vede k mnoha falešných pozitivních výsledků. Radioizotop značení bylo použito Ge et al. (22), radioizotop značení pro studium protein-protein, protein-DNA, protein - lékových interakcí na filtrační pole. Zhu et al. použita radioizotop značení na chování kinázy testy na různých substrátech pomocí kvasinek čištěný kinázy bílkovin na pole (36). Upřednostňovanou metodou detekce je fluorescenční detekcí, protože tyto metody jsou obecně bezpečné, velmi citlivé , Jednoduché a může mít velmi vysokým rozlišením. Tyto detekční metody jsou rovněž kompatibilní s normou Microarray skenery. Generally, a chip is either directly probed with a fluorescent molecule (eg a fluorescently labeled protein or small molecule, by using a tagged probe (eg biotin), which can then be detected in a second step using a fluorescently labeled affinity reagent (eg streptavidin) (16,56). Another fluorescent labeling method is rolling circle amplification (RCA), which is also extremely sensitive (32). Obecně řečeno, čip je buď přímo sondoval s fluorescenční molekuly (např. fluorescenčně označené bílkovin nebo malé molekuly, pomocí označené sondy (např. biotin), který pak může být zjištěn v druhém kroku pomocí fluorescenčně označené afinitu činidla (např. Streptavidin ) (16,56). Jinou metodou je fluorescenční značení kolejových kruhu zesílení (RCA), který je také velmi citlivý (32).
Although the proteomes under comparison can be labeled in a comparable fashion with fluorophores, the reproducibility of these chemical reactions is poor and interference with the protein-antibody interactions presents an additional complexity (9). Ačkoli proteomes v porovnání mohou být označeny jako ve srovnatelném s módní fluorophores, reprodukovatelnost těchto chemických reakcí je špatná a rušení s protein-protilátka interakcí představuje další složitosti (9). Also, non-uniform labeling of proteins can be addressed by performing a dual-colour ratiometric assay, where an internal standard is present for each target protein which is measured (9). Také, ne-jednotného označování proteinů, lze řešit provedením dvojí-barevné poměrné testu, kdy je vnitřní standard je přítomen na každém cílovém proteinu, který je měřen (9). ÿÿÿÿÿÿÿÿ A disadvantage of labeling proteins with fluorophores is a reduction of the quantitative accuracy of the assay, as incorporation of the label may alter the binding properties of the proteins (9). Nevýhodou na označování proteinů s fluorophores je snížení kvantitativní přesnost rozboru, jak začlenění štítek může změnit závazné vlastností proteinů (9).

Although direct protein labeling detection methods are still widely used, the intrinsic problems mentioned has resulted in the increasing use of label free detection methods for protein microarrays.ÿ These methods are mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (AFM) (70), and surface plasmon resonance (SPR) (71). Přestože přímé značení bílkovin detekční metody jsou stále široce používané, vnitřní problémy uvedené má za následek zvyšující se využívání volného štítek detekčních metod pro bílkoviny microarrays. Tyto metody jsou hmotnostní spektrometrie (MS), mikroskopie atomárních sil (AFM) (70), a plocha plasmon rezonance (SPR) (71).
Non-labeling methods have advantages as a direct detection approach for antibody microarrays since labeling molecules affects protein activity. Non-labeling metody mají výhody, jako přímý přístup k detekci protilátek proti microarrays, protože značení molekul bílkovin ovlivňuje činnost. SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) mass spectrometry has been used to detect low-density arrays of captured proteins (69). SELDI (Surface-posílené laserová desorpce / ionizace) hmotnostní spektrometrie byla použita k detekci-nízká hustota pole zachyceného na bílkoviny (69). Proteins are captured on a metal surface array (SELDI protein array) and are vapourized using a laser beam.ÿ Analysis using mass spectrometry data is then performed in order to reveal the identities of these proteins. Proteiny jsou zachyceny na kovovém povrchu array (SELDI bílkovin pole) a jsou vapourized pomocí laserového paprsku. Analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie údajů je pak provedena s cílem odhalit totožnost těchto proteinů.

Atomic force microscopy (AFM) method uses surface topological changes to identify the captured proteins on an antibody array (70). Mikroskopie atomárních sil (AFM) způsob využití plocha topologické změny identifikovat zachyceného bílkovin na protilátky pole (70). ÿWhen rabbit IgG is immobilized on a gold surface and binds to its complimentary antibodies, goat ant-rabbit IgG, AFM detects the increase in height, and thus is able to measure binding interactions.ÿ However in order to study the kinetics of antigen–antibody interactions, real-time detection methods will be useful. Když králičí IgG je imobilizován na povrch zlata a váže na její bezplatné protilátky, kozí ant-králičí IgG, AFM zjistí zvýšení výšky, a tak je schopna měřit závazné interakcí. Aby však studovat kinetika interakce antigen-protilátka , Real-time detekčních metod bude užitečné. ÿSurface plasmon resonance (SPR) has matured into a versatile detection tool to study the kinetics of receptor–ligand interactions with a wide range of molecular weights, affinities and binding rates (72-74). Plocha plasmon rezonance (SPR) je splatná do univerzální nástroj pro odhalování studovat kinetika receptor-ligand interakce s celou řadou molekulové hmotnosti, spřízněnosti a závazné sazby (72-74). Commercial SPR chips are available however their detection resolution is limited.ÿ A sensor surface with 64 individual immobilization sites in a single flow cell was developed (75).ÿ An antibody array biosensor was also developed to study the kinetics of antigen binding using a planar waveguide as the detection method. Obchodní SPR čipy jsou však k dispozici jejich odhalování usnesení je omezená. Snímač plocha s 64 vinkulace jednotlivých lokalit do jediného toku buněčných byl vyvinut (75). Protilátka pole biosensor byl také vyvinut pro studium kinetiky antigenu závazné pomocí rovinného jako vlnovod detekční metody. Using this method, the group demonstrated that significant signal intensity could be achieved from spots as small as 200ÿmm in diameter. Použití této metody skupiny prokázáno, že významný signál intenzity by mohlo být dosaženo z úhlů, jak malý jako 200 mm v průměru. It is therefore expected that this approach will be suitable for high-throughput and parallel kinetics studies. Proto se očekává, že tento přístup je vhodný pro vysoce-průchodnost a paralelní studium kinetiky. (76).

Range of Detection Rozsah detekce
Another difference between protein and DNA microarrays is that protein concentrations in a single biological sample or cells are several orders of magnitute greater than that for mRNAs.ÿ Thus protein chip detector systems must have a very large range of detection operation – up to a factor of 1014, compared to 104 for mRNA.ÿ Thus an antibody with nanomolar affinity to a particular target will be saturated by the presence of this target at micromolar concentrations and will fail to detect pico- or femtomolar target levels.ÿ Thus accommodating rare and abundant proteins will probably require separate arrays (7,8,9). Další rozdíl mezi proteiny a DNA microarrays je, že koncentrace proteinu v jediném vzorku nebo biologických buněk je několik objednávek na magnitute větší, než pro mRNAs. Tedy bílkovin čip detektoru systémy, musí mít velmi široké spektrum detekčních provoz - až na faktor 1014 , Ve srovnání s 104 na mRNA. Tak protilátky se nanomolar afinitu k určitým cílovým bude nasycen tím, že na tento cíl na micromolar koncentrací a nedojde k detekci pico-femtomolar nebo cílových hodnot. Respektu tak vzácné a bohaté proteiny bude pravděpodobně vyžadovat samostatné pole (7,8,9).
Multiple antibodies with varying affinities for the target may be positioned at different areas of the array however studies have shown that only 20% of arrayed antibodies provide measurements of proteins at low concentrations (33). Mnohonásobný protilátek s různou orientaci na cíl může být umístěn v různých oblastech, na poli však studie prokázaly, že pouze 20% z seřadil protilátky poskytují měření bílkovin v nízkých koncentracích (33).

Next: Protein Production for Protein Arrays Další: Výroba Bílkoviny Bílkoviny pro Arrays

References for Protein and Antibody Microarrays Odkazy na bílkoviny a Antibody Microarrays

Back to: Návrat:

Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. Úvod a pozadí na Bílkoviny Chips a Antibody Chips.

Types of Antibody and Protein Chips Typy protilátek a bílkovin Chips