Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

PCR Protocols PCR protokolů	PCR Bioinformatics and Databases PCR Bioinformatika a databáze	Learn about PCR Získejte informace o PCR	PCR Kits and Products PCR sady a produkty	PCR Forum PCR fórum	PCR Books PCR Knihy

Successful PCR Conditions Úspěšné PCR Podmínky

Parameters for Successful PCR Parametry pro úspěšné PCR

Are you having problems of achieving a successful PCR?ÿ Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.ÿ Also Thermal Cycling Considerations:ÿ PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. Jste s problémy na dosažení úspěšné PCR? Mnoho faktorů může ovlivnit vaše výsledky na vašem PCR, jako jsou: Metal Ion Cofactors, substrát a substrát analogy, Buffery a soli a Cosolvents. Také tepelného Cyklistika Úvahy: PCR nádobách, teploty a času na optimalizaci, PCR amplifikační Cykly, enzymové / Cíl a Hot Start.

Metal Ion Cofactors and PCR Metal Ion Cofactors a PCR

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.ÿ Its concentration must be optimized for every primer:template system. Základním cofactor pro DNA polymerázu v PCR je chlorid hořečnatý. Její koncentrace musí být optimalizovány pro každý primer: šablony systému. Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. Mnohé ze součástí reakce váží hořečnaté ionty, včetně matric, šablon, PCR produktů a dNTPs. The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. Hlavní 1:1 závazné agent pro hořečnaté ionty je vysoká koncentrace dNTPs v reakci. Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. Protože to je nezbytné pro volný hořečnaté ionty, který bude sloužit jako enzym cofactor v PCR, celková koncentrace hořčíku ionty musí být vyšší než celková koncentrace dNTP. Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. Zpravidla platí, že ke spuštění optimalizační proces, 1,5 mM chlorid hořečnatý, který zní na PCR v přítomnosti 0,8 mM dNTPs celkem. This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. Zbývá přibližně 0,7 mM zdarma hořčíku pro DNA polymerázu. In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. V zásadě platí, hořčíku ionty by se měla měnit v koncentraci řadě od 1.5-4.0 mm na 0,5 mM kroky.

Substrates and Substrate Analogs for PCR Substrátu a substrát analogy pro PCR

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.ÿ They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. DNA polymerases začlenil velmi efektivně dNTPs. Rovněž může zahrnovat modifikované substráty, pokud jsou používány jako doplňkové složky v PCR. Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. Příklady substrátů používaných pro DNA polymerázu jsou: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, a fluorescenčně označené dNTPs. For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. Pro konvenční PCR, koncentrace dNTPs zůstává vyvážený v equimolar poměry, např. 200 μ M každý dNTP. Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. Také si uvědomte, že odchylky od těchto standardních doporučení mohou být prospěšné v některých amplications. For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. Například, když náhodná mutageneze na konkrétní cíl je žádoucí, nevyrovnaná koncentrace dNTP podporovat vyšší stupeň misincorporations o DNA polymerázu.

Buffers and Salts for PCR Buffery a soli pro PCR

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. V závislosti na DNA polymerázu použita optimální PCR pufru koncentrace, koncentraci soli, pH a je třeba si vybral proto, aby DNA polymerázu. The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. PCR pufr pro Taq DNA polymerázu se skládá z 50 mM KCl a 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, při pokojové teplotě. This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. Tato vyrovnávací paměť poskytuje sílu iontových a absorbční kapacitu potřebnou během reakce. It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. Je důležité si uvědomit, že koncentrace soli ovlivňuje Tm na klíč: šablony duplex, a tím i teplota žíhání.

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. Různé PCR Cosolvents se používají ke zvýšení výnosu, účinnost a specifičnost PCR amplifications. These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. Tyto cosolvents může být výhodné v některých amplifications, a nevýhodné v ostatních amplifications. It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. Je nemožné předvídat, jaké doplňkové látky budou užitečné pro každého primeru: šablony duplex a proto cosolvent musí být empiricky testován pro každou kombinaci.

Thermal Cycling Considerations Tepelná Cyklistika Úvahy

PCR Vessels PCR Plavidla

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. PCR musí být provedeny v nádobách, které jsou kompatibilní s malým množstvím enzymů a nukleových kyselin a že mají dobré tepelné vlastnosti převodu. Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. Obvykle se používá pro polypropylen PCR plavidel a konvenční, tlustý-zděný mikroodstředivku trubky jsou vybíráni na mnoha cycler termální systémy. PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. PCR se nejčastěji provádí na 10-100 μ L reakci rozsahu a vyžaduje prevenci z odpařování / kondenzace procesy v uzavřené reakční zkumavky při tepelné cyklistiku. A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. Minerální oleje nebo překrýt vrstvou vosku slouží tomuto účelu. More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. Více nedávno, 0.2-ML tenký-obezděný plavidel byly optimalizovány pro PCR procesu a olej-volný tepelné cyclers byly navrženy tak, že použití vyhřívané pokrytí více než trubky konat ve vzorku bloku.

Temperature and Cycle Time Optimization Cyklus teplota a čas Optimalizace

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. Podstatné je, že reakční směsi dosáhnout denaturace, žíhání, prodloužení a teploty v každé tepelné cyklu. If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. Je-li nedostatečná doba je uvedena v každém teplota, teplota vzorku nebude equilibrated se, že ve vzorku bloku. Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. Některé tepelné cycler vzorů doby se drží interval na základě blokové teploty, zatímco jiní založit doba provozu na předpovídané teploty vzorku. If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. Pokud tradiční husté-zděný trubice používané v cycler ovládané blokové teplota, 60-to je dostatečná doba k vyrovnání. Extra time may be recommended at the (72øC) extension step for longer PCR products. Extra doba může být doporučena na (72 ø C) po dobu delší prodloužení kroku PCR produktů. Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. Pomocí tenké-zděný 0,2-mL zkumavky v cycler kontrolovány předvídané vzorku teploty, pouze 15 s je vyžadováno. To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. Chcete-li využívat stávající protokoly nebo na vývoj protokolů pro použití v několika laboratořích, to je velmi důležité vybrat si drží krát v závislosti na cycler design a tloušťka stěny trubky.

PCR Amplification Cycle Number PCR amplifikační cyklus Počet

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. Počet PCR amplifikace cykly by měly být optimalizovány s ohledem na počáteční koncentraci cílové DNA. It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. Doporučuje se, že od 40 - 45 cyklů doplnit 50 cílových molekul, a 25-30 cyklů doplnit 3 × 105 molekul ke stejnému spojení. This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. To ne-proporcionality je způsobeno tím, tak-zvané plató efekt, v němž ke snížení exponenciální sazba produktu hromadění dochází v pozdních fázích a PCR. This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. To může být způsobeno zhoršení kvality reactants (dNTPs, enzym); reaktant vyčerpání (základní nátěr, dNTPs), konec-produkt inhibice (pyrofosforečnan formace), soutěže pro reactants, kteří nejsou-specifické produkty, nebo soutěže pro primerů vazba reannealing koncentrované ( 10 nM) výrobku. It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. Je obvykle vhodné pro provoz minimální počet cyklů potřebných k podívejte se na požadovanou konkrétní produkt, protože nechtěné nespecifický výrobků bude zasahovat v případě, že počet cyklů je příliš vysoké.

Enzyme / Target Enzymu / Úkol

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. Ve standardním alikvotní Taq DNA polymerázu a používané pro 100 - μ L reakci, je asi 1010 molekul. Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. Každý PCR vzorku by měla být hodnocena na počtu kopií cílové obsahuje nebo může obsahovat. For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. Například 1 ng lambda DNA obsahuje 1,8 × 107 výtisků. For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. Pro nízký-vstupní počtu kopií PCR, enzym se stává omezení a může být nezbytné, aby proces rozšíření vzestupně více času. Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. Tepelná cyclers může spolehlivě plnit tento segment automatické prodloužení řízení, s cílem maximalizovat výnos pro PCR.

Hot Start Conditions Hot Start Podmínky

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. Všechny výše uvedené optimalizace použijí i na PCR, že je navržen tak, od počátku, s teplém startu metody. Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. Často hot start může být úspěšně začleněny do předem optimalizované pro PCR reakci, aniž by došlo ke změně podmínek. However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. Je však obvykle platí na reoptimize po přidání teplém startu. Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. Optimalizace je často rovnováhu mezi výrobními tolik produktu, jak je to možné a overproducing nespecifický, pozadí amplifications. Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. Protože teplém startu výrazně snižuje amplifications zázemí, horní omezení jsou chována v podmínkách, jako je koncentrace enzymu, cyklus číslo, a kovové ionty cofactor spojení. Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. Citlivé PCRs, které byly vysoce naladěný bez teplém startu může selhat, když se horký start je přidána. This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. To může být způsobeno mírným zpožděním v raných cyklů způsobených smícháním nebo enzymatické aktivaci. The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. PCR obvykle může být obnovena, často s podstatným zvýšením konkrétní produkt, pouhým zvýšením omezit parametry nebo činidla. In addition, there are optimizations specific to each hot start method. Kromě toho jsou optimalizace specifické pro každý teplém startu metody. Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. Míchání nebo aktivaci enzymu může být ovlivněna PCR objemu, vyrovnávací paměť složení a pH, cosolvents, cykloturistika podmínky, a tak dále. The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. Specifického produktu literatury, často produktu vkládat, by měla být konzultována na informace o těchto úvah.