Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

Mass Spectrometry Hmotnostní spektrometrie

What is a Mass Spectrometer? Co je to hmotnostní spektrometr?

A mass spectrometer is based on the simple fact that different chemicals have different masses, and this is what determines what chemicals are present in a sample. Hmotnost spektrometr je založen na jednoduché skutečnost, že různé chemické látky mají rozdílné hmotnosti, a to je to, co určuje, jaké chemické látky jsou přítomny ve vzorku. There are many types of mass spectrometers that not only analyze the ions differently but produce different types of ions; however they all use electric and magnetic fields to change the path of ions in some way. Existuje mnoho typů hmotnostní spektrometry, že nejen analyzovat ionty různě, ale vyrábět různé typy iontů, nicméně všichni použití elektrického a magnetického pole změnit cestu iontů v nějakém směru.

During the late 1980s and early 1990s, two new methods of sample ionization caused mass spectrometry to undergo a revolution in biopolymer analysis, namely ESI 38 and MALDI.39 Just over a decade ago, for the first time, mass spectrometric techniques that could measure the molecular masses of femtomole quantities of proteins in excess of 100 kDa, often to better than 0.01% accuracy, became widely available to protein chemists. Během pozdního 1980s a začátkem 1990s, dvě nové metody vzorku ionizaci způsobené hmotnostní spektrometrie, aby se podrobil revoluce v biopolymeru analýzy, a to ESI 38 a MALDI.39 Jen o něco více než deseti lety poprvé, hmotnostně spektrometrické metody, které by mohly měřit molekulovou hmotností femtomole množství bílkovin než 100 kDa, často lépe než 0,01% přesnost, se stal široce dostupné na bílkoviny lékárnách. These methods are both successful in forming ions from large, labile biomolecules without significant degradation of the analyte. Tyto metody jsou úspěšné při tvorbě iontů z velkých, labilní biomolekul bez výrazných rozklad analytu. Not only are they both sensitive techniques but also speedy – both MS and MS/MS sequence spectra can be acquired within seconds. Nejenže jsou oba citlivé techniky, ale také rychlé - oba MS a MS / MS spekter sekvence lze získat během několika vteřin. ESI and MALDI, due to their many differences, are complementary and many biopolymer laboratories have access to both techniques. ESI a MALDI, vzhledem k jejich mnoho rozdílů, se vzájemně doplňují a mnoho biopolymeru laboratoře mají přístup do obou technik.

Sample preparation: 2-Dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry Příprava vzorků: 2-dimenzionálním elektroforéza a hmotnostní spektrometrie

Sample separation, isolation and preparation for the mass spectrometric techniques generally, involves 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), a technique that can separate as many as 5000 different proteins in a single experiment. Ukázka separace, izolace a přípravy na masové spektrometrické techniky obecně, zahrnuje 2-DE (2-Dimenisional Elektroforeza), což je technika, která může samostatných tolik jako 5000 různých bílkovin v jednom experimentu. In general, 2-DE is capable of separating proteins within an isoelectric point (pI) range of 3.5–10 and of molecular masses ranging from 6 to 300 kDa, as well as being able to distinguish between post-translationally modified proteins (eg phosphorylated) and their non-modified companions. V obecné, 2-DE je schopen oddělit proteiny v isoelectric point (PI) rozsah 3.5-10 a molekulárních hmotností v rozmezí od 6 do 300 kDa, stejně jako je schopen rozlišovat mezi post-translationally modifikované bílkoviny (např. fosforylovány ) A jejich non-modifikované společníky. Once separated, the protein components are revealed by staining techniques (eg silver stain, fluorescent stain, Coomassie blue) and once located they can then be extracted from the gel. Jakmile bude oddělen, bílkoviny komponenty se ukázalo, o barvení techniky (např. stříbra barvení, fluorescenční barvení, Coomassie modř) a jednou nachází pak budou moci být vytažen z gelu. Proteins cannot easily be eluted from gels without the use of detergents, which are detrimental to the mass spectrometric analysis; additionally, large proteins tend to be heterogeneous (eg as a result of glycosylation) and so possesses no single molecular mass which can be related to the corresponding entry in a database. Bílkoviny nemohou být snadno eluováno z gelů bez použití čisticích prostředků, které jsou škodlivé pro hmotnostní spektrometrie v analýze; dodatečně, velké bílkoviny mají tendenci být heterogenní (např. v důsledku glykosylačních) a tak bude mít žádný molekulové hmotnosti, které mohou souviset s odpovídající záznam v databázi. To overcome these obstacles, the elution step tends to be accomplished after the protein has been digested by an aqueous acetonitrile wash of an excised gel piece. K překonání těchto překážek se eluci krokem bývá dosaženo po bílkovin bylo tráveno podle vodného acetonitrilu vymytí z vynechal gel kus. This increases the yield of extraction 5 and by using an in-gel digestion method employing trypsin, which has been described and is widely used as published or with minor modifications, produces a MS-compatible sample from which a protein identification can be made. Tím se zvyšuje výtěžnost extrakce 5 a pomocí in-gel metoda trávení zaměstnává tripsinu, který byl popsán a je běžně používána jako zveřejněné nebo s drobnými změnami, vytváří MS-kompatibilní vzorek, ze kterého proteinu identifikace může být provedena. The digestion step can be preceded by an optional reduction and alkylation step to cleave and block disulfide bridges that exist between cysteine residues. Trávicí krok lze předcházet tím, volitelné redukce a alkylace krok k rozdělil, a zablokovat disulfid mosty, které existují mezi cystein zbytků. Robotic systems have been developed to automate the excision of protein spots from the 2D-gel, to carry out the subsequent enzymatic digestion and to transfer the samples onto MALDI-MS target plates for the initial MS analysis. Robotické systémy byly vyvinuty pro automatizaci excize bílkovin skvrny od 2D-gel, aby provedla následné enzymatické trávení a převést vzorků na MALDI-MS cílové desky pro původní MS analýzy. For many applications, the peptides recovered from in-gel digestions require concentration and purification before being analysed by mass spectrometry especially if ESI is the ionization method used. Pro mnoho aplikací, peptidy vrácena z in-gel digestions vyžadují soustředění a čištění dříve, než budou analyzovány hmotnostní spektrometrie zejména v případě, ESI je ionizační použité metody. Reversed phase high performance liquid Obrácenou fází vysoce účinnou kapalinovou
chromatography (HPLC) is one method of achieving this; another method involves the use of ZipTips (Millipore) (pipette tips packed with C18 material) or Poros R2 perfusion material (Perseptive Biosystems). chromatografie (HPLC) je jeden způsob, jak toho dosáhnout, jiná metoda vyžaduje použití ZipTips (Millipore) (špičky pipet balena s C18 materiálu) nebo Poros R2 perfuze materiál (Perseptive Biosystems). Despite its widespread acceptance, the limitations of 2-DE include the exclusion of very small or very large proteins, very acidic or very basic proteins, as well as hydrophobic proteins such as membrane proteins. I přes jeho široké přijetí, je omezení na 2-DE zahrnují vyloučení velmi malé nebo velmi velké bílkoviny, velmi kyselá nebo velmi základní bílkoviny, stejně jako hydrofobní proteiny, například membránové proteiny. It is thought that Má se za to, že
only 20% of the gel-loaded proteins can be visualised and analysed. pouze 20% z gelu-naložené bílkovin může být visualised a analyzována. Other constraints are that the amount of sample that can be loaded is limited causing the non-observance of Jiné omezení je, že množství vzorku, které mohou být nahrány je omezena příčinou ne-dodržování
low concentration proteins and also that the most commonly used staining techniques have non-linear response factors. nízkou koncentraci proteinů a také, že nejčastěji používané techniky barvení mít ne-lineární faktory. In practice, 2-DE is a labour intensive process involving manual handling steps that offer the opportunity for impurities such as keratin to contaminate the samples. V praxi to znamená, 2-DE je na pracovní sílu procesu, který zahrnuje ruční manipulaci kroky, které nabízejí příležitost k nečistot, jako jsou keratiny, aby ke kontaminaci vzorků. One 2-D gel will take a day to complete and about one month for a complete structural analysis by MS, although automation can help both the contamination problem and speed up the analysis to some extent. Jeden 2-D gel budou mít denně k úplné a asi jeden měsíc pro kompletní strukturální analýzu od MS, i když automatizace může pomoci jak problém kontaminace a urychlení analýzy do jisté míry.

Alternative protein separation techniques Alternativní separaci bílkovin techniky

Alternative, MS-compatible methods of protein preparation are under development but no one technology has emerged as a universal replacement. Alternativní, MS-kompatibilní metody přípravy bílkoviny jsou ve vývoji technologie, ale nikdo se objevil jako univerzální náhradní. These methods aim generally to interface the protein sample directly to MS/MS analyses thereby eliminating time-consuming sample preparation steps and the need for a preliminary MS analysis. Cílem těchto metod obecně na rozhraní bílkoviny vzorku přímo do MS / MS analýzy a tím odstranit časově náročné-příprava vzorků kroky a že je třeba na předběžné MS analýzy. Capillary isoelectric focusing (CIEF)-MS and preparative isoelectric focusing followed by size exclusion chromatography-MS are methods that have been compared in depth with 2-DE in terms of separation effciency, peak capacity, precision and robustness, with the former appearing the more favourable alternative.The direct analysis of complex peptide mixtures from a mixture of proteins using on-line, reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC)-MS/MS has been used successfully as an alternative to 2DE and this has led onto multidimensional chromatography if greater peptide separation is desirable prior to the MS/MS analyses. Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)-MS a preparativní isoelectric zaměřením následuje velikost vyloučení chromatografie-MS jsou metody, které byly do hloubky ve srovnání s 2-DE, pokud jde o odluku effciency, špičkové kapacity, přesnost a důkladnost, s bývalou objevuje čím více příznivé alternative.The přímou analýzu komplexních peptidových směsí ze směsi bílkovin pomocí on-line, obrácenou fází vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) -MS/MS byl úspěšně použit jako alternativa k 2DE a to vedlo do multidimenzionální chromatografii, pokud větší peptid separace je žádoucí před MS / MS analýzy. Examples of two dimensional chromatography include anion or cation exchange followed by reversed phase HPLC and size exclusion chromatography followed by reversed phase HPLC. Příklady ze dvou rozměrových chromatografie patří aniontu nebo kationtu následuje obrácená fáze HPLC a velikost vyloučení chromatografie následuje obrácená HPLC. Another, alternative approach has been to use combined solid-phase micro-extraction together with capillary electrophoresis(CE) coupled to ESI MS/MS for the analysis of a total protein tryptic digest. Jiný, alternativní přístup byl pro použití v kombinaci pevná fáze-mikro-těžbě společně s kapilární elektroforéza (CE) vázanou na ESI MS / MS pro analýzu celkových proteinů tryptic digest. This method afforded high resolution separation of the peptide fragments allowing the identification of 80–90% of the proteins in this particular yeast ribosome complex. Tato metoda poskytované vysokým rozlišením oddělení těchto peptidové fragmenty umožňující identifikaci 80-90% bílkovin v tomto konkrétním droždí ribozomu složité. Coupling microfluidic devices to MS is a further strategy that combines sample handling and separation, as well as interfacing neatly with nano-ESI-MS analysis.A different approach for selective protein fractionation and identification uses ProteinChip technology (Ciphergen) which employs a surface capture method using antibodies or chemically modified surfaces to capture specific classes of proteins which are then analysed by MALDI-MS. Microfluidic spojovacího zařízení na MS je další strategie, která kombinuje vzorku manipulaci a dělení, stejně jako propojení s úhledně nano-ESI-MS analysis.A odlišný přístup k selektivní frakcionace bílkovin a identifikace používá ProteinChip technologie (Ciphergen), které zaměstnává plocha způsob zachycování pomocí protilátek nebo chemicky upravované plochy pro zachycení zvláštních tříd proteinů, které jsou pak analyzovány MALDI-MS. This technique, known as Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI)-MS35, has great potential for the comparison of the protein content of different samples. Tato technika, známá jako povrchové Užší Laserová desorpce Ionizační (SELDI)-MS35, má velký potenciál pro porovnávání obsahu bílkovin z různých vzorků.