Welcome to Molecular Station! Vítejte na molekulární Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musíte se registrovat, než budete moci odeslat na naše fóra, nebo využít naše moderní prvky. Register Now! Zaregistrujte se nyní! Its Free and Fast! Jeho svobodný a Fast!

Already registered? Už jste se zaregistroval? Login now below. Přihlášení nyní níže.

User Name: Uživatelské jméno:

Password: Heslo:

Remember Me? Zapamatovat si?

Already registered and Forgot your password? Už jste se zaregistroval a Zapomněli jste heslo? Click below to recover it. Klikněte níže k zpětnému to.

Recover Lost Password Získat zpět ztracené heslo

Join now - it's fast and free! Připojte se nyní - je to rychlé a zdarma!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekulární stanice je největší síť výzkumných pracovníků, vědců a vědy milovníky kdekoliv!

Recent Forum Posts Nový fóru

DNA Protocols DNA protokoly

DNA Encyclopedia DNA Encyklopedie

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatika

DNA Forum DNA fórum

DNA Blog DNA Blog

DNA News DNA Novinky

DNA Books DNA Knihy

Genomic DNA Isolation Protocol Izolace genomické DNA protokolu

Selecting a Genomic DNA Purification Method Výběr genomické DNA Čištění Metoda

The goal of genomic DNA isolation depends on what the applications of the DNA after isolation. Cílem genomické DNA izolace závisí na tom, co aplikace DNA po izolaci. Purity, source, quantity and quality of DNA are all issues that need to be addressed prior to genomic DNA extraction. Čistota, zdroje, množství a kvalitu DNA se všemi problémy, které je třeba se zabývat před genomické DNA extrakce. A whole host of different methods, technologies and kits are available now to researchers to isolate genomic DNA from cells. Celá řadu různých metod, technologií a sestavy jsou nyní k dispozici pro výzkumné pracovníky k izolaci genomické DNA z buněk.

• Quantity of DNA needed Množství DNA potřebné
• Molecular weight and size of DNA Molekulové hmotnosti a velikosti DNA
• Purity of DNA required Čistota DNA požadované
• Downstream applications of DNA Následných žádostí o DNA
• Time available Čas k dispozici
• Ease of DNA extraction technique or method Ease DNA extrakční techniku nebo metodu
• Expense or money available Náklady nebo peníze k dispozici

Home-grown or laboratory specific DNA extraction methods often quite well for labs that have developed them and regularly use these protocols. Home-pěstované nebo laboratoř specifické metody extrakce DNA, často docela dobře pro laboratorní cvičení, které se vyvinuly a pravidelně používat tyto protokoly.

Note however these methods lack standardization. Všimněte si však tyto metody postrádají normalizace. Also the DNA yield and DNA quality are not always reproducible from one person to the next. Také výnos DNA a DNA kvality nejsou vždy reprodukovatelné z jedné osoby na druhou.

Background on Genomic DNA Isolation and Purification Pozadí na genomické DNA izolace a čištění

Generally, all methods involve the disruption and lysis of cells. Obecně platí, že všechny metody zahrnují narušení a lýze buněk. This is followed sometimes by the removal of RNA (by RNAses, salt or other methods). Toto je následované někdy o odstranění RNA (o RNAses, sůl nebo jiné metody). Choosing which method to use will depend on many selection factors including: Výběr kterou metodu použít, bude záviset na mnoha faktorech včetně výběru:

DNA is isolated from proteins by several methods including digestion of proteins by the enzyme proteinase K. Proteins are removed subsequently by salting-out, organic extraction, or binding of the DNA to a solid-phase support (such as an anion-exchange column or silica technology). DNA je izolována od bílkovin z několika metod, včetně trávení proteinů pomocí enzymu K. proteináza proteiny jsou následně odstraněny solením-out, ekologické těžbě, nebo závazných z DNA na pevný-fáze podpory (např. anion-exchange sloupci nebo křemen technologie).

DNA is finally recovered by ethanol precipitation or isopropanol precipitation. DNA je konečně regenerovat etanolu srážek nebo isopropanolu srážkami.

In general, the separation of DNA from cells and cellular components can be divided into four stages: Obecně platí, že separace DNA z buněk a buněčných složek lze rozdělit do čtyř fází:

1. Cell disruption Buňka narušení
2. Lysis of Cell Lýze buněčné
3. Removal of Proteins and Contaminants Odstraňování proteinů a kontaminujících
4. Recovery of DNA Využití DNA

In some genomic DNA isolation protocols, stages 1 and 2 are combined. V některých genomické DNA izolace protokoly, etap 1 a 2 je kombinovaná.

Materials Needed for Genomic DNA Extraction Method Materiály potřebné pro genomické DNA Těžba Metoda

Lysis Buffer for Genomic DNA Recipe: Lýze vyrovnávací paměť pro genomické DNA Recepty:

50 mM Tris-HCl, pH 8.0 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
50mM EDTA 50mm EDTA
1% SDS 1% SDS
10mM NaCl 10mm NaCl

Genomic DNA Purification Method from Tissue Samples Purifikace genomické DNA z Metoda vzorky tkáně

1. Select tissue sample to use. Vyberte vzorek tkáně k použití. Make sure the sample is properly prepared and kept on ice. Ujistěte se, že je vzorek řádně připraveny a vedeny na led. If the sample will not be used immediately for DNA extraction, then the samples must be stored properly in either -20øC freezer for longer term or 4øC for short term (few hours) usage. Je-li vzorek nebude použit okamžitě pro extrakci DNA, pak vzorků musí být řádně skladováno v obou mrazák -20 ø C na delší dobu nebo 4 ø C pro krátkodobý (několik hodin) použití.
2. Cut tissue into smaller pieces. Řezané tkáň na menší kousky. For liver or other soft tissue, don't worry about making fine pieces. Pro jater nebo jiné měkké tkáně, dělat si starosti o zadávání jemné kousky.
3. Add tissue to a pre-cooled (dry ice) mortar, immediately add liquid nitrogen N2. Přidat tkáně do předem-cooled (suchý led) malty, hned přidejte kapalný dusík N2.
4. Begin to grind tissue into fine powder. Zahájit grind tkáně do jemného prášku. Add more Liq. Přidat více Liq. N2 as needed. N2 podle potřeby. Transfer cold powder to 30 ml tube, leave uncapped so N2 can evaporate. Převod studený prášek na 30 ml zkumavky, nechat neomezený tak N2 může odpařit.
5. Add 9 ml of per-warmed (5øC ) Lysis buffer and gently resuspend powder. Přidat 9 ml za-teplotu (5 ø C) lysis pufru a jemně resuspendujte prášek.
6. Add 100 ul of 10mg/ml of Proteinase K, (ie, 100 ug in solution). Přidat 100 ul na 10mg/ml na Proteinase K, (tj. 100 ug v roztoku). Incubate 55øC 1-18 hours. Inkubujte 55 ø C, 1-18 hodin. Mix gently periodically. Promíchejte jemně pravidelně. Add 100 ul of Proteinase K after first 2 hours, Optimum: 3 hours adding Proteinase K at 1.5 hours. Přidat 100 ul na Proteinase K po první 2 hodiny, Optimum: 3 hodiny přidání Proteinase K na 1,5 hodiny.
7. Treat sample very gently. Zacházet velmi jemně vzorku. Add 1 ml of 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml of warm (55øC ) phenol, mix gently but throughly for 5-10 minutes. Přidá se 1 ml 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml teplé (55 ø C) fenol, směs jemně, ale důkladně na 5-10 minut.
8. Centrifuge samples for 15 minutes. Centrifug vzorky po dobu 15 minut.
9. Repeat warm phenol extraction. Opakujte teplé fenolové extrakce.
10. Extract with equal volume (10ml) phenol: CIA (1 part phenol:1 part CIA: CIA= 23 parts chloroform:1 part isoamyl alcohol) Extrakt se stejným objemem (10 ml) fenol: CIA (1 část fenol: 1 část CIA: CIA = 23 dílů chloroformu: 1 část isoamylalkoholu)
11. Extract with equal volume (10ml) CIA extraction Extrakt se stejným objemem (10 ml) extrakčního CIA
12. Upper phase should be relatively clear, If it contains large white clouts, or is very milky, (i) incubate at 68øC 15 min., and re-phenol extract, (ii) start again, but incubate longer with PK. Horní fáze by měla být poměrně jasné, pokud obsahuje velké bílé clouts, nebo je velmi mléčnou, (i) inkubovat při 68 ø C 15 min., A znovu fenol-extrakt, (ii) začít znovu, ale již se inkubovat PK.
13. Transfer upper phase to new tube. Převod horní fázi do nové zkumavky. Add 2 volumes of cold ethanol and mix gently (Salt: Na0Ac is already in solution). Přidají se 2 objemy studené etanolu a jemně promíchejte (Salt: Na0Ac je již v řešení). Using a hook and sealed pasteur pipet spool out DNA. Hákem a uzavřených pasteur pipetovat spool v DNA. Wipe off excess ethanol on the side of the tubes. Setřít přebytek etanolu na straně trubky. Resuspend in 2-5 mls of TE. Ponořte ve 2-5 mls na TE. Make sure DNA is completely dissolved (leave on gentle shaker.) Ujistěte se, že DNA je zcela rozpustí (dovolená na jemné třepačce.)
14. Add RNase mix (100 ug of RNase A, 10U of RNaseT1). Přidat RNase mixu (100 ug na RNase A, 10U na RNaseT1). Incubate 30 min 37øC. Inkubujte 30 min 37 ø C. ** You could add the RNase before the proteinase K, incubate at 37øC for 1 hour and then start proteinase digestion. ** Můžete přidat RNase před proteináza K, inkubovat při teplotě 37 ø C po dobu 1 hodiny a potom začít proteináza trávení. You could then skip step 15-. Ty by pak mohla vynechat krok 15 -.
15. Add 100 ug of Proteinase K, incubae 37øC 30 minutes. Přidá se 100 ug na Proteinase K, incubae 37 ø C 30 minut.
16. Add 1/10 vol. Přidá se 1 / 10 roč. 3M Na0Ac, Phenol extract once, Phenol:CIA extract twice, CIA extract once. 3M Na0Ac, Fenol výpis jednou, Fenol: CIA výtažek dvakrát, CIA výpis jednou.
17. Add 2.5 volumes of EtOH, put in -20øC 30 min. Přidat 2,5 objemu EtOH, uveden do -20 ø C 30 min. Centrifuge 20 min. Odstřeďujte 20 min.
18. Wash well with 70%, Remove all EtOH. Mycí a s 70%, odebrat veškeré EtOH. If you dry, Do Not over DRY. Pokud vás suchý, že není nad suchý.
19. Resuspend carefully, slowly in1-2mls TE (Tris-EDTA buffer). Ponořte opatrně, pomalu In1-2mls TE (Tris-EDTA pufru). (1x or 0.1x). (1x nebo 0.1x).

Other DNA Protocols and Methods Ostatní DNA protokoly a metody

DNA Cloning Guide Klonování DNA Průvodce

DNA Gel Electrophoresis Gel DNA elektroforézu

Restriction Enzyme Digestion - all you need to know ! Omezení enzymové Domácí lékárnička - vše co potřebujete vědět!

Genomic DNA Isolation Protocol Izolace genomické DNA protokolu

Baceteria DNA Isolation Baceteria Izolace DNA

DNA Transformation - Contains History of DNA DNA Transformace - Obsahuje Historie DNA

Find other protocols at our DNA Protocols external resource directory or see our DNA protocols . Najít další protokoly v naší DNA protokoly vnějších zdrojů, nebo adresář naleznete v naší DNA protokoly.

Related: Související:

DNA Microarray Protocols DNA Microarray protokoly

PCR Protocols PCR protokolů

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatika

Visit DNA Bioinformatics . Navštivte DNA, bioinformatiky.

DNA-Related News DNA-Related News

DNA News DNA Novinky