Molecular Biology Blog Molekulární biologie Blog

Assaying DNA- Protein Interactions Assaying DNA-Protein Interakce

Learn about how to assay DNA-protein interactions. Získejte informace o tom, jak k rozboru DNA-proteinových interakcí.

Assaying DNAProtein Interactions Assaying DNAProtein Interakce

There are four important techniques for assaying DNA-protein interactions. K dispozici jsou čtyři důležité techniky pro assaying DNA-proteinových interakcí. The first two techniques (Filter Binding and Gel Mobility Shift) determine if your DNA is interacting with protein. První dvě techniky (Filtr Vazba a gel mobility Shift) určit, zda je vaše DNA je interakce s bílkovinnými. The other two techniques (DNase Footprinting and DMS Footprinting) indicate where the target site of interaction between protein and DNA lies on the DNA. Dalších dvou technik (DNase Footprinting a DMS Footprinting) uvede, kde jsou cílové stránky interakce mezi proteiny a DNA spočívá v DNA.

Filter Binding Filtr Vazba

Nitrocellulose membrane filters are commonly used to filter-sterilize solutions. Nitrocelulóza membránové filtry se běžně používá pro filtrování-sterilizovat řešení. Nitrocellulose filters can bind DNA, but only under certain conditions. Nitrocelulóza filtry lze vázat DNA, ale pouze za určitých podmínek. Singlestranded DNA binds readily to nitrocellulose, but double stranded DNA by itself does not. Singlestranded DNA váže snadno k nitrocelulóza, ale dvojí uvízlých DNA sama o sobě není. On the other hand protein does bind, and if a protein is bound to double-stranded DNA the protein-DNA complex will bind. Na druhé straně se bílkoviny váží, a je-li protein je vázán na double-uvízlých DNA bílkoviny-DNA komplex bude zavazovat. Please refer to Nitrocellulose Filter Binding Assay article for more information. Obraťte se prosím na Nitrocelulóza Filtr Závazné Puncovní článek pro více informací.

Gel Mobility Shift Gel mobility Shift

In order to measure DNA-protein interactions this technique relies on the simple fact that a small DNA has a much higher mobility in gel electrophoresis than the same DNA does when it is bound to a protein. Za účelem měření DNA-proteinových interakcí této techniky spočívá v jednoduché skutečnosti, že malé DNA má mnohem vyšší mobilitu v gelu, elektroforéza, než stejné DNA dělá, když je vázána na bílkoviny. We therefore can label a sort double stranded DNA fragment, then mix it with a protein, and electrophorese the complex. Jsme tedy schopni označit jakési dvojí uvízlých DNA fragmentu, pak promícháme s bílkovin, a electrophorese složité. Then we subject the gel in autoradiography to detect the labeled species. Pak jsme se s výhradou gel v autoradiografie, aby zjistil označené druhů. The small size of the DNA is important in this assay. Malá velikost DNA je důležité v tomto testu. If a whole gene were used its mobility would already be very low, and the mobility shift caused by protein binding would be difficult to detect. Pokud celku genu byly použity jeho mobilita by již být velmi nízká, a mobility na směny způsobené Vazba na bílkoviny je obtížné odhalit. Therefore we must know approximately where the protein binds to the DNA so we can prepare a short restriction fragment, or even a synthetic double-stranded oligonucleotide that will contain the target site for the protein, but little else. Proto musíme vědět, kde přibližně bílkoviny se váže na DNA, abychom mohli připravit krátký fragment omezení, nebo dokonce syntetických double-uvízlých oligonukleotid, který bude obsahovat cílové stránky na bílkoviny, ale trochu jiný.

DNase Footprinting DNase Footprinting

Once we know that a protein binds to a given DNA we can use footprinting to find out where the target site lies on the DNA. Jakmile budeme vědět, že protein se váže na určité DNA, můžeme použít footprinting, aby zjistil, kde je cílová stránka leží na DNA. Dnase footprinting relies on the fact that a protein, by binding to DNA, covers the binding site and so protects it from attack by Dnase. Dnase footprinting spoléhá na skutečnost, že bílkovina, podle vazby na DNA, se vztahuje na závazné stránce a tak ji chrání před útoky prostřednictvím Dnase. In this sense it leaves a "footprint" on the DNA. V tomto smyslu to zanechá "stopy" v DNA. The first step in a footprinting experiment is to end-label the DNA. První krok v footprinting experiment je na konci-štítek DNA. We can label either strand, but only one per experiment. Můžeme etiketě buď část, ale jen jednu na experimentu. Next, we bind the protein to the DNA. Dále jsme zavázání proteinů na DNA. Then we treat the DNA-protein complex with Dnase I under mild conditions (very little Dnase), so that an average of only one cut occurs per DNA molecule. Pak jsme se zacházet s DNA-proteinových komplexu s Dnase I za mírné podmínky (velmi málo Dnase) tak, že v průměru pouze jeden střih dochází na DNA molekuly. Next, we remove the protein from the DNA, separate the DNA strands, and electrophorese the resulting fragments on a high resolution polyacylamide gel alongside size markers. Dále se odstraní bílkovin z DNA, oddělit řetězců DNA, a electrophorese výsledné fragmenty na vysoké rozlišení polyacylamide gel vedle velikosti značky. Fragments will arise from the other end of the DNA as well, but we will not detect them because they are unlabeled. Střípky bude vyplývat z jiných konci DNA, ale nebudeme odhalovat jim, protože oni jsou unlabeled. We always include a control with DNA alone (no protein), and usually use more than one protein concentration so we can see by the gradual disappearance of the bands in the footprint region that protection of the DNA depends on the concentration of the added protein. Vždy obsahují kontrolu s DNA sám (bez bílkovin), a obvykle používají více než jeden proteinů, abychom mohli vidět o postupném mizení kapely v regionu, stopu, že ochranu DNA závisí na koncentraci přidané bílkoviny. The footprint represents the region of DNA protected by the protein, and therefore tells us where the protein binds. Na stopu představuje region DNA chráněny prostřednictvím bílkovin, a proto nám říká, kde se váže na bílkoviny.

DMS Footprinting DMS Footprinting

Dnase footprinting gives a good idea of the location of the binding site for the protein, but Dnase is a macromolecule and is therefore a rather blunt instrument for probing the fine details of the binding site. Dnase footprinting dává dobrou představu o umístění vázání stránky na bílkoviny, ale Dnase je makromolekula a je proto poměrně strohá nástroj pro testování pokuty podrobnosti o závazné stránkách. Which means, that there may be gaps in the interaction between protein and DNA that Dnase would not fit into and therefore would not detect. Což znamená, že mohou existovat rozdíly v interakci mezi proteiny a DNA Dnase, že by se nevešel do a proto by nebylo odhalit. Moreover, DNA binding proteins frequently perturb the DNA within the binding region, distorting the double helix. Navíc, DNA proteinů vázajících často znepokojovat DNA ve závazné regionu, což deformuje dvojšroubovice. These perturbations are interesting, but are not generally detected by Dnase footprinting because the protein keeps the Dnase away. Tyto perturbations jsou zajímavé, ale nejsou obecně detekovány Dnase footprinting, protože bílkoviny uchovává Dnase pryč. To do more detailed footprinting, we need a smaller molecule that can fit into the nooks and crannies of the DNA-protein complex and reveal more of the subtleties of the interaction. Chcete-li podrobnější footprinting, potřebujeme menší molekuly, které lze uložit do koutky a crannies na DNA-bílkovina komplexní a odhalují více z odstínům na interakci. A favorite tool for this job is the methylating agent dimethylsulfate (DMS). Oblíbený nástroj pro tuto práci je methylating agent dimethylsulfate (DMS).

With DMS footprinting we start off in the same way as in Dnase footprinting, by end-labeling the DNA and binding the protein. S DMS footprinting jsme začít, a to stejným způsobem jako v Dnase footprinting, do konce roku-značení DNA a závazné bílkoviny. Then we methylate the DNA-protein complex with DMS, using a mild treatment so that on average only one methylation even occurs per DNA molecule. Pak jsme methylate DNA-proteinových komplexu s DMS s použitím mírné zacházení tak, že v průměru pouze jeden dokonce dochází za methylace DNA molekuly. Next, we dislodge the protein, and treat the DNA with a reagent that removes methylated purines, creating apurinic sites (deoxyriboses without bases) on the DNA. Dále jsme vytlačit bílkovin, a zacházet s DNA a činidla, která odstraňuje denaturovaný purinů, tvorba apurinic stránky (deoxyriboses bez základů) na DNA. Then we break the DNA at these apurinic sites. Pak jsme přestávku DNA apurinic na těchto stránkách. These reactions are the same as the Maxam-Gilbert DNA sequencing reactions. Tyto reakce jsou stejné jako Maxam-Gilbert DNA sekvenování reakce. Finally we electrophorese the DNA fragments and autoradiograph the gel to detect the labeled DNA bands. Nakonec jsme electrophorese DNA fragmentů a autoradiograf gel ke zjišťování DNA označenou kapel. Each band ends next to a nucleotide that was methylated and thus unprotected by the protein. Každá kapela končí vedle nukleotidový že byl metylovaný a tedy nechráněné o bílkoviny.