Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatika, protokoly, DNA, RNA bílkovin Proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologie Home protokoly bioinformačních nástrojů biologie Fórum molekulární biologie Encyclopaedia molekulární biologie Obrázky Přidat k oblíbeným!

home > dna > cdna-cloning > index.php home> dna> cDNA-klonování> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molekulární biologie Domů Věda Sport Věda Video DNA, RNA bílkovin Proteomics výzkum BETA! Bioinformatika Lab Vybavení molekulární biologie Techniky molekulární biologie Produkty a služby související Biologie Odkazy

Molecular Biology Blog Molekulární biologie Blog

Send this page to a friend Pošlete tuto stránku svému příteli

Intracellular Stations Intracelulární stanic

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Protilátka botaniky společného Vymazat Vymazat Alphabetic Knihkupectví buněčné biologie a kulturu gel Elektroforeza histologie Microarrays imunologie Mass Spectrometry mikrobiologie Molekulární Imaging peptid Proteomics Bílkoviny Microarray Chips PCR, Real-Time PCR a siRNA RNAi Stonek Buňka Biologie transfekce Western Blot

DNA Protocols DNA protokoly

DNA Encyclopedia DNA Encyklopedie

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatika

DNA Forum DNA fórum

DNA Blog DNA Blog

DNA News DNA Novinky

DNA Books DNA Knihy

cDNA Cloning Klonování cDNA

Learn about cDNA cloning. Získejte informace o klonování cDNA.

cDNA Cloning Klonování cDNA

A cDNA (short for complemantary DNA or copy DNA) is a DNA copy of an RNA, usually an mRNA. A cDNA (zkratka pro complemantary DNA nebo kopie DNA) je kopií DNA z RNA, obvykle mRNA. Sometimes we want to make a cDNA library, a set of clones reprensenting as many as possible of the mRNAs in a given cell type at a given time. Někdy chceme, aby se cDNA knihovna, soubor klonů reprensenting co nejvíce z mRNAs v určitém typu buněk v dané době. Such libraries can contain tens of thousands of different clones. Tyto knihovny může obsahovat několik desítek tisíc různých klonů. Other times, we want to make one particular cDNA- aclone containing a DNA copy of just one mRNA. Ostatní časy, chceme, aby se jednoho konkrétního cDNA-aclone obsahující kopií DNA na mRNA jen jeden. This technique we use depends in part on which of these goals we wish to achieve. Tato technika je používáme, závisí z části na které z těchto cílů jsme chtěli dosáhnout.

cDNA Libraries cDNA knihovny

If we want to build a cDNA library, we can use a simple but effective strategy that relies on a process called nick translation. Pokud chceme vybudovat cDNA knihovny, můžeme použít jednoduché, ale účinné strategie, která spoléhá na proces zvaný nick překladu. The essence of nick translation is the simultaneous removal of DNA ahead of a nick (a single-stranded DNA break) and synthesis of DNA behind the nick. Podstatou překlad přezdívky je současné odstranění DNA dopředu o přezdívka (jediné-uvízlých DNA přestávce) a syntézu DNA za přezdívky. The net result is to move, or translate the nick in the 5'-3' direction. Čistý výsledek je přemístit nebo přeložit jméno uživatele v 5'-3 'směrem. The enzyme we usually use the nick translation is E.coli DNA polymerase I, which has a 5'-3' exonuclease activity that allows the enzyme to degrade DNA ahead of the nick as it moves along. Enzym se obvykle používají přezdívky překlad je E. coli DNA polymerázu I, který má 5'-3 'exonuclease činnost, která umožňuje enzym rozkládat DNA před jméno uživatele, protože se pohybuje společně.

The central part any cDNA cloning procedure is synthesis of the cDNA from an mRNA template using reverse transcriptase. Ústřední součástí jakékoli klonování cDNA postup je syntéza z cDNA z mRNA šablony pomocí reverzní transkriptázy. Reverse transcriptase is like any other DNA-synthesizing enzyme is that it cannot initiate DNA synthesis without a primer. Reverzní transkriptázy je, podobně jako u jiných DNA-slučující enzymu je, že nemůže zahájit syntézu DNA bez primeru. To get around this problem, we take advantage of the poly(A) tail at the 3'-end of most eukaryotic mRNAs and use oligo(dT) as the primer. Chcete-li dostat kolem tohoto problému, budeme těžit z toho poly (A) ocasu na 3'-konec většiny eukaryontní mRNAs a použití oligo (dT) jako zápalku. The oligo(dT) is complementary to poly(A), so it binds to the poly(A) at the 3'-end of the mRNA and primes DNA synthesis, using the mRNA as a template. Na oligo (dT) je komplementární k poly (A), tak to se váže na poly (A) na 3'-end z mRNA a prvočísla syntézu DNA, za použití mRNA jako šablonu.

After the mRNA has been copied, yielding a single-stranded DNA (the "first strand"), we partially degrade the mRNA with ribonuclease H (RNase H). Po mRNA byl kopírován, přináší jediné-uvízlých DNA (dále jen "první část"), jsme částečně poškozují mRNA s ribonukleázy H (RNase H). This enzyme degrades the RNA strand of an RNA/DNA hybrid- just what we need to begin to digest the RNA from our first strand cDNA. Tento enzym Degraduje RNA složky z RNA / DNA hybrid-jen to, co musíme začít strávit RNA z naší první část cDNA. The remaining RNA fragments serve as primers for making the "second strand," using the first as the template. Zbývající fragmenty RNA slouží jako základní nátěr pro podání "druhé fáze", s použitím nejprve jako šablony. This is the nick-translation phase of the process and again, E. coli DNA polymerase I is the enzyme we use to carry out the nick-translation reaction. To je přezdívka-překlad fáze tohoto procesu a znovu, E. coli DNA polymerázu I se enzymu, které používáme k provedení nick-překlad reakci. The net result is a double-stranded cDNA with a small fragment of RNA at the 5'-end of the second strand. Čistým výsledkem je dvojí-uvízlých cDNA se malý zlomek z RNA na 5'-konci druhé části programu.
Our next task is to ligate the cDNA to a vector. Náš další úkol je podvázat na cDNA do vektoru. This was easy with our pieces of genomic DNA cleaved with restriction enzymes, but cDNAs have no sticky ends. To bylo snadné se naše kousky genomické DNA rozštípl s omezením enzymy, ale cDNAs nemají lepivý končí. We can ligate blunt ends together, even though that is a relatively inefficient process. Můžeme podvázat tupé konce dohromady, a to i přesto, že je poměrně neefektivní proces. However, if we want the efficient ligation afforded by sticky ends, we can tack sticky ends (oligo[dC]) onto the cDNA, using an enzyme called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) or simply terminal transferase and one of the deoxribonucleoside triphosphates. Nicméně, pokud chceme, aby efektivní ligatura poskytované lepkavá končí, můžeme připíchnout lepkavá končí (oligo [dC]) na cDNA pomocí enzymu nazývá koncová deoxynucleotidyl transferázy (TdT), nebo prostě terminálu transferázy a jeden z deoxribonucleoside triphosphates. In the case, we use dCTP. V případě, používáme dCTP. The enzyme adds dCMPs, one at a time, to the 3'-ends of the cDNA. Enzym dodává dCMPs, jeden po druhém, na 3'-konce z cDNA. In the same way, we attach oligo(dG) ends to our vector and allow the oligo (dC)s to anneal to the oligo(dG)s. Ve stejné cestě, přikládáme oligo (GŘ) končí na našem vektoru a umožní oligo (DC) je k popouštět na oligo (GŘ) s. This brings the vector and cDNA together in a recombinant DNA that can be used directly for transformation. To přináší vektoru a cDNA spolu s rekombinantní DNA, které mohou být použity přímo pro transformaci. The base pairing between the oligonucleotide tails is strong enough that no ligation is required before transformation. Základní párování mezi oligonukleotidové orel je dostatečně silné, že žádná ligatura je vyžadováno před transformací. The DNA ligase inside the transformed cells finally performs the ligation. DNA ligase uvnitř transformovaných buněk nakonec provádí ligatura.

See the DNA Molecule in 3-Dimensions Viz Molekula DNA v 3-Rozměry