Welcome to Molecular Station! Добре дошли в молекулярна станция!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Трябва да се регистрирате преди да можете да публикувате на нашите форуми, или да използвате допълнителни функции. Register Now! Регистрирайте се! Its Free and Fast! Тяхното свободно и бързо!

Already registered? Вече сте регистрирани? Login now below. Вход за сега по-долу.

User Name: Име:

Password: Парола:

Remember Me? Запомни ме?

Already registered and Forgot your password? Вече сте регистрирани и Забравили сте паролата си? Click below to recover it. Кликнете по-долу, за да го възстанови.

Recover Lost Password Забравена Забравена парола

Join now - it's fast and free! Присъединете се към момента - това е бързо и безплатно!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Молекулярна станция е най-голямата мрежа от изследователи, учени и любители на науката навсякъде!

Recent Forum Posts Нова Форум постове

RNA Protocols РНК протоколи

RNA Encyclopedia РНК енциклопедия

RNA Bioinformatics РНК Биоинформатика

RNA Forum РНК форум

RNA Blog РНК Blog

RNA News РНК Новини

RNA Isolation РНК Изолация

RNA Extraction Background Information РНК извличане на справочна информация

Obtaining high quality, intact RNA is the first and often the most critical step in performing many fundamental molecular biology experiments, including Northern analysis, nuclease protection assays, RT-PCR, RNA mapping, in vitro translation and cDNA library construction. Получаване на високо качество, непокътнати РНК е първата и често най-важните стъпки в изпълнение на много от основните молекулярната биология експерименти, включително и Северна анализ, защита nuclease тестове, RT-PCR, РНК картиране, ин витро превод и cDNA библиотека строителство. To be successful, however, the RNA isolation procedure should include some important steps both before and after the actual RNA purification. За да бъде успешна, обаче, че РНК изолация процедурата трябва да включва някои важни стъпки, както преди, така и след действителната РНК пречистване.

Basic RNA Isolation Methods Основните методи за изолиране на РНК

Depending on the RNA to be extracted, there are properties of RNA that allow it to be isolated away from other cellular materials such as proteins, DNA and even lipids. В зависимост от РНК да бъде извлечена, има свойствата на РНК, които позволяват тя да бъде изолирана далеч от други клетъчни материали, като например протеини, ДНК, и дори липиди.

Messenger RNA or mRNA contains a stretch adenosine residues in the form of a poly(A) tail. Messenger РНК или mRNA съдържа участък аденозин остатъци във формата на поли (А) на опашката. This has been exploited to allow mRNA to be bound to poly(T) affinity columns or beads. Това е била използвана за да позволи mRNA да бъде обвързана с много (Т) афинитет колони или мъниста.

Tips for RNA Extraction and Isolation Съвети за РНК добив и Изолация

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Ако вече притежавате предлага метод за изолиране РНК, продължават да я използват.

If you haven't isolated RNA from your system before and your organism is not on the following list, we can help you identify established protocols that have been used for isolating RNA for Northern blotting or RT-PCR from your system. Ако не сте изолирана РНК от вашата система и, преди да ви организъм не е в следния списък, за да можем да ви помогне да идентифицирате, установени протоколи, които са били използвани за изолиране на РНК Северна blotting или RT-PCR от вашата система. These types of protocols will also yield "microarray-grade" RNA. Тези видове протоколи, също ще добива "microarray-клас" РНК.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Винаги пуснете agarose гел на своите РНК за оценка на качеството.

NOTE: If you use a non column based purification reagent such as TRIzol we recommend you precipitate your RNA a second time from ethanol or you pass it through an Rneasy column or similar device. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако ползвате без колоната за пречистване на базата реактив като TRIzol ние ви препоръчваме да утайка ви РНК за втори път от етанол или сте го чрез Rneasy колона или подобно устройство. This insures removal of all organic contaminants (See spectra below). Това гарантира отстраняването на всички органични замърсители (Виж спектри по-долу).

RNase Inhibitors Used in RNA Extraction and Isolation RNase инхибитори, използвани в РНК добив и изолация

Checking RNA Isolation Quality and Quantity Проверка на РНК изолация качеството и количеството

Efficient nuclear/cytoplasmic fractionation can be quickly assessed by denaturing agarose gel analysis (see Figure 1). Ефективни ядрената / cytoplasmic фракциониране най-бързо могат да бъдат оценени от денатуриране agarose гел анализ (вж. Фигура 1). Bands correspond-ing to precursor rRNA should be equivalent in the total and nuclear RNA fraction. Групи съответства-създаването на предшественика rRNA трябва да бъдат равностойни на общия и ядрени РНК фракция. The 18S and 28S rRNA bands will be less intense in the nuclear RNA fraction than in either total RNA or cytoplasmic fraction RNA. В 18S и 28S rRNA банди ще бъдат по-малко интензивно в ядрената част от РНК и в двата общото РНК или cytoplasmic фракция РНК. In some cell lines, for example 293 and COS-7 cells, this difference will be dramatic, but in other cells lines such as HeLa cells, the rRNA bands are only slightly less intense in nuclear RNA than in total or cytoplasmic fraction RNA." В някои клетъчни линии, например 293 и COS-7 клетки, тази разлика ще бъде драматична, но и в други клетки линии, като например Лов клетки, rRNA ленти са само малко по-малко интензивно с ядрени РНК, отколкото в общата част или cytoplasmic РНК. "

RNA Purity РНК Чистота

A260 readings and 260/280 ratios are not enough to ensure high purity RNA. A260 четения и 260/280 съотношения, не са достатъчно, за да се гарантира висока чистота РНК. You must take a full UV spectrum. Вие трябва да вземе пълна UV спектъра. Below are 3 example spectra which all have good 260/280 ratios, but have very different purities. По-долу са 3 пример спектри на всички, които имат добра 260/280 съотношения, но са много различни purities. You can also use the 260/230 ratio to help determine the amount of organic contamination in your RNA. Можете също така да използвате 260/230 сметка, за да определи размера на органичното замърсяване в РНК. It is a much more variable number than the 260/280 ratio, but generally, ratios above 1 indicate good purity. Тя е много по-променлив брой от 260/280 съотношение, но като цяло, над 1 съотношения показват добра чистота.

Quantifying RNA Extraction and Isolation Преброим РНК добив и изолация

RNA Isolation from Subcellular Fractions РНК изолирано от Subcellular фракции

Cells were then washed in PBS and successively extracted as described. Клетките са били измити след това в PBS и последователно, извлечени, както е описано. First, cells were extracted with the Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Първо, клетки бяха извлечени с Nonidet P-40 буфер (10 мм три-Cl, (рН 7,5), 10 мм NaCl, 3 мм MgCl2, 0,5% (обем / обем) Nonidet P-40, 40 единици / мл Rnasin, 1 мм DTT). The remaining pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) and nucleus) was washed in the same buffer and extracted in buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 mM EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Останалите pellet (груб endoplasmic reticulum (RER) и ядро) е измити в същия буфер и добитите в буферната Б (10 мм три-Cl (рН 7,5), 10 мм NaCl, 0,5% (обем / обем) Nonidet P-40 , 40 мм EDTA, 40 единици / мл Rnasin, 1 мм DTT). The remaining nuclear pellet was washed in the same buffer and extracted with high salt buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Останалите ядрени pellet се мият в същия буфер и сол, извлечена с висока буферна (10 мм три-Cl (рН 7,5), 0,5 M NaCl, 3 мм MgCl2, 0,5% (обем / обем) Nonidet P-40, 40 единици / мл Rnasin, 1 мм DTT). RNA was purified from each fraction by the RNA STAT solution. РНК е пречистена от всяка фракция от РНК държава-разтвор. Total RNA was isolated using the RNA-STAT60 reagent (Tel-test) according to the instructions provided by the manufacturer. Общо РНК е изолиран чрез РНК-STAT60 реагент (Тел-тест) в съответствие с указанията, предвидени от производителя. (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002) (Референция: Byeong-Churl Жанг и др., 2002)

RNA Isolation Using CsCl Protocol РНК използват за изолиране на CsCl Протокол

Chaos Buffer for RNA isolation Хаос на буфера за изолиране на РНК

For 100 mls 200 mls За 100 МЛС 200 МЛС

4. 5M Guanidinium thiocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls 5 м Guanidinium тиоцианат 53,2 грама 106,4 2% n-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0 гр 4.0 гр 50mM EDTA 0.5M 10 МЛС 20 МЛС 25mM три-HCl, рН 7,5 1M 2,5 МЛС 5 МЛС

0. 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls 1M б-mercaptoethanol 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul 2% antifoam А (Сигма) 200 ул ул 400

5. 7 M CsCl cushion* Final Volume 100 ml 7 млн. CsCl намалят негативните * Финал обем 100 мл

5. 7 M "Baked" CsCl 95.8g 7 М "фурна" CsCl 95.8 грама

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls 1M EDTA 0.5M 20 МЛС

RNA Extraction Procedure Using CsCl РНК добив процедура използване на CsCl

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Ползвайте DEPC третират водата и печени изделия. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Това решение, абсолютно, трябва да бъде положително Rnase безплатно. Rnase is everywhere! Rnase са навсякъде! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Носят ръкавици, използвайте само печени изделия, необработени или пластмасови. DePC treat your water, buffers (except Tris). DePC лечение на вашата вода, буферите (с изключение на три). Be very careful. Бъдете много внимателни.

1. Weigh animal. Weigh животните. Remove organ (liver), weight One of the superior attributes of cDNA is you reduce the gene complexity by choosing an organ that only expresses a single locus of a multilocus enzyme. Премахване на органи (черен дроб), тегло Един от атрибутите на cDNA се чувствате вие се намали сложността произлязъл от избора на орган, че само изразява едно място на multilocus ензим. 2 . 2. Homogenize tissue rapidly in "Chaos" buffer (9mls) 3 . Homogenize тъкан бързо в "Хаос" буфер (9mls) 3. Spin homogenant at 12 KG to remove insoluble material 4 . Спин homogenant по 12 kg за отстраняване на неразтворими материали 4. WHILE Homogenant IS SPINNING 4A. WHILE Homogenant Е предене 4 а. Weight out 1.8 g of CsCl (0.2g/ml) per sample. Тегло на 1,8 грама на CsCl (0.2g/ml) на пробата. 4B. 4 б. In the ultra-centrifuge tube ("quick-seal") add 3.5mls of 5.7M CsCl "cushion" This layer must be Rnase free. В ултра-центрофуги тръба ( "дълбоко печат") добави 3.5mls на 5.7M CsCl "намалят негативните" Този слой трябва да бъде Rnase безплатно. You will centrifuge your RNA through this layer and any contamination will cause significant losses. Ще ви центрофуги РНК чрез този слой и замърсяването ще причини значителни загуби. 5 . 5. Remove supernant, put into fresh tube, add 1.8 g CsCl 6 . Премахване на supernant, пуснати в прясно тръба, добавете 1,8 грама CsCl 6. Carefully, add homogenant on top of the CsCl cushion. Внимателно добавете homogenant в горната част на CsCl намалят негативните. This is most readily accomplished by using a 10cc syringe and long needle. Това се постига най-лесно с помощта на 10cc спринцовка и игла дълго. Place needle/syringe into quick-seal tube, and add tissue homogenant to the syringe. Поставете иглата / спринцовка в дълбоко печат тръба, и добави тъкан homogenant към спринцовката. Homogenant will slowly trickle into QS tube, floating on top of the cushion. Homogenant ще Малко бавно в QS тръба, плаващи в горната част на намалят негативните.

7. Carefully, balance matched pairs of centrifuge tube (+/-0.005 g). Внимателно, баланс на съвпадащите чифта центрофуги тръба (+ / -0,005 ж).

8. Seal tubes, place matched tubes opposite of each other and cap with red aluminum tops. Печат тръби, мястото, съвпадащи тръби срещу един от друг и алуминиева капачка с червени едно от най-сериозните.

9. Centrifuge, 50,000 rpms 5.5 hrs, 20oC Центрофуги, 50.000 rpms 5,5 часа, 20oC

After centrifugation: Mark tubes where pellet should be: on the bottom outer side (relative to center of rotor) След центрофугиране: Марк pellet тръби, където трябва да бъде: на дъното външната страна (в сравнение с центъра на ротора)

10. Remove tubes, place in convenient rack. Премахване на тръби, в удобен багажник.

11. Slice off the top of tube.Aspirate off the top 2/3- 3/4 of solution. Резен на разстояние от началото на tube.Aspirate на разстояние от началото 2/3- 3 / 4 от разтвора. WORK FROM THE TOP DOWN. Работа от върха надолу. IT IS IMPORTANT THAT YOU ASPIRATE OFF THE UPPER MOST SOLUTION FIRST AND REMOVE ALL BUT THE CLEAR CUSHION. Това е важно да ASPIRATE на разстояние най-горния разтвор първо и премахнете всички, но ясно CUSHION. DO NOT ASPIRATE THE INVISIBLE PELLET AT THE BOTTOM. Да не се ASPIRATE Невидимата създадете в долната част.

12. Cut off the top 2/3 of tube. Отрязан началото 2 / 3 от тръбата. Using a "pulled" Pasteur pipet, carefully remove remaining solution. Използването на "изтеглена" Пастьор pipet, внимателно да отстрани оставащите решение. The pellet will be on the bottom-side of the tube. В pellet ще бъде на дъното страна на тръбата.

13. Rinse pellet with 70% EtOH, remove (use Pasteur pipets), repeat twice (total 3 washes) Ябълков pellet със 70% EtOH, премахнете (използване Пастьор pipets), повторете два пъти (общо 3 измива)

14. Add 200 ul of 0.1x TE (RNase free), using the pipet tip to crush pellet and "titrating" TE attempt to put pellet into solution. Добавете 200 на ул 0.1x ВЕ (RNase свободни), като се използва pipet върхът на хлътнал съм pellet и "titrating" ТЕ се опитват да въведат pellet в разтвор. At least form a heterogeneous solution and put into a fresh microfuge tube. Най-малко са хетерогенна решение и пуснати в нов microfuge тръба.

15. Repeat with 200 ul of TE pooling both solutions Повторете с 200 на ул ВЕ обединяване на двете решения

16. Vortex, good RNA does not like to go into solution. Вихрите, добри РНК не искал да отиде в разтвор. Patience is a virtue. Търпението е силата.

17. Determine concentration, 10 ul into 490 ul (500 ul final vol) Определете концентрацията, 10 ул под 490 ул (500 окончателен ул об)

18. Remove 1 to 2 ug of RNA for gel analysis (add RNA loading buffers) Премахване на 1 до 2 ug на РНК гел за анализ (РНК добавите зареждането на буферите)

19. Add 1/10 volume Rnase free 3M NaOAC (40 ul), 2.5 volumes of EtOH (1.0ml). Добавете 1 / 10 обема Rnase свободна 3M NaOAC (40 ул), 2,5 обемите на EtOH (1.0ml). Mix vigorously. Разбърква се енергично.

20. You can calculate the concentration of RNA in the EtOH.Thus, there is no need to precipitate all of your RNA at once. Може да се изчисли концентрацията на РНК в EtOH.Thus, няма нужда да утайка всичките си РНК наведнъж. Just remove about 1.5 to 2 times the amount you need by vortexing EtOH/RNA solution and remove the appropriate volume. Просто премахване на около 1,5 до 2 пъти повече от сумата, имате нужда от vortexing EtOH / РНК решение и отстраняване на подходящ обем. This EtOH/RNA solution stored at 20oC or lower, is stable for years. Това EtOH / РНК решение, съхранявани в 20oC или по-ниска, е стабилна в продължение на години.

See: Вижте:

RNA Protocols РНК протоколи

RNA Bioinformatics РНК Биоинформатика