home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php начало> протеин> отстраняване на проблеми-Западно-blots> index.php
 |
|---|
The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! Молекулярната станция Ръководство за Западните Blotting Проблеми и решения: Обща Western Blot Проблеми и решения за тях!
Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Моля свържете се с нас със своите идеи, ако можете да добавите към това ръководство.
Membrane is Glowing in the Dark Room Мембрана е Светещите в мрака Room
Too many Bands in Western Blot Твърде много банди в Западна Blot
Troubleshooting Western Blots Problem: Отстраняване на неизправности в Западна Blots проблема:
Spots on Film (missing bands) : Спотове на кино (липсва ленти):
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Лошо Трансфер дължи на въздушните мехурчета по време на трансфер до мембрана
- dirty film when adding to the developer -- Мръсни, когато филмът добавяне на разработчика
- developer rolls are dirty -- Разработчик роли са мръсни
Solution to spots on film: Решение на петна върху филма:
- use a pasteur pipette as a roller. -- Използване на Пастьор пипета като ролери. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. хвърли мембрана и гел преди трансфера да премахнете мехурчета. keep membrane and materials wet. мембрана води и материали мокър.
- keep film clean before adding to the developer -- Чисти води филма, преди да добавите към разработчика
Troubleshooting Western Blots Problem: Отстраняване на неизправности в Западна Blots проблема:
Too Many Bands in Western Blot : Твърде много банди в Западна Blot:
- usually due to many non-specific bands -- Обикновено се дължи на много от които не са специфични групи
- poor primary antibody quality or old antibody -- Лошо качество на първичното антитяло или антитела стари
- not enough blocking -- Не се прави достатъчно за блокиране
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytic cleavage на антиген - всички допълнителни ленти са по-ниски, отколкото ви MW протеин, (т.е. протеин ви се открият, но е деградирали)
Solutions to too many bands on western blot: Решения на твърде много групи от Западните blot:
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Закупуване на антитела или друга замени с прясно антитяло фондова
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Блок с 5% сухо мляко без мазнини или BSA преди да добавите първичен. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Ако вече сте блокиране, помислете за блокиране по време на първични и вторични антитяло incubations, а също и увеличаване на блокиране на мляко или BSA концентрация.
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Съхранява всичко на лед, използвайте пресни проби, в магазина - 80C, както и използването протеазни инхибитори, като PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: Отстраняване на неизправности в Западна Blots проблема:
High background; low signal to noise ratio on Western Blot Висока фон; нисък сигнал / шум на Западните Blot
- black or every dark film; film was exposed too long -- Черно или тъмно всеки филм; филм е изложено твърде дълго
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Блокиране е недостатъчна; не-конкретни обвързващи на първични и вторични антитела, антитела не са измити напълно
- washing was insufficient -- Измиване е недостатъчна
- film glows in dark! -- Glows филм в тъмно! - too high secondary or primary dilutions -- Твърде висока вторична или първична разреждания
Solutions to Dark Film: Решения на тъмно Филм:
- expose for less time, decrease exposure time -- Излагат за по-малко време, намалява времето на експозиция
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Увеличаване на продължителността на блокиране без мазнина сухо мляко, 5% инкубационен или увеличаване на концентрацията.
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Също така можете да опитате с блокиране на целия серум на приемащата с животните (или преди) вторичното антитяло
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Увеличаване на времето за измиване и обеми, за да премахнете всички случаи на неспазване на конкретни сигнала поради слаб антитяло задължителни.
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Използва по-силен препарат за измиване - Вместо TBST (Tween-20), използват силни препарати като NP-40 или SDS, които могат да осигурят по-строги измиване и намаляване на заден план (направите това само ако групата е силна! - Измиване и премахва някои своя банда на интереси!)
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Много високо средно антитела (или дори основната) концентрация - извършване на експерименти за оптимизиране да се определи правилното антитяло разреждания. dilute the antibodies further. размиване на антитела срещу допълнително.
Troubleshooting Western Blots Problem: Отстраняване на неизправности в Западна Blots проблема:
Low Signal or Weak Signal Ниска сигнал или слаб сигнал
- due to not enough protein loaded on the gel -- Не се дължи на достатъчно протеини, натоварени на гела
- primary antibody is old or not good -- Първичното антитяло е стар или не е добра
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Phospho-протеини, обикновено се нуждаят овърнайт първичното антитяло инкубационен
- not enough secondary antibody -- Не е достатъчно средно на антитела
- over-blocking -- Над-блокиране
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Разработване на реагентите са лоши / сте направили грешка при подготовката им
Solutions to Low Signal or Weak Signal : Решения за ниско сигнал или слабост на сигнала:
- load more protein sample onto gel -- Натоварване повече протеини проба върху гел
- try fresh primary antibody -- Опитайте пресни първичното антитяло
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Incubate първичното антитяло overnite за phosphoproteins към 4 градуса С (студена стая shaker)
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Увеличаване на концентрацията на протеини (lyse проби за по-малко разпад буфер)
- decrease concentration of blocking agent -- Намаляване концентрацията на блокиране на агента
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Проверка на развиващите се реагенти; подготвят прясно ECL и ре-ECL на мембрана
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Увеличаване на концентрацията или дължината на първичното антитяло инкубационен период
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Увеличаване на концентрацията и продължителността на средното антитяло инкубационен период
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Размито ленти, Бандероли Smeared, Бандероли не Шарп
- bands smeared due to hot gel -- Ленти smeared дължи на гореща гел
- bands fuzzy due to high voltage -- Ленти, размита поради високо напрежение
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Решения за Размито ленти и ООН рязко Групи:
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Намаляване на напрежението или ток, пускат в студена стая, и се подготвят нови вървят буфер. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Топлината причинява гел, за да загуби своята здравина и неговото решаване мощност)
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Предварително soak трансфер мембрана в съответния трансфер разтвор (определена от производителя мембрана), необходими за продължителността на времето.
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Отговорности / Условия за ползване | Поверителност | © 2005-2007 молекулярна Station.com, Всички права запазени.
Send this page to a friend Изпратете страницата на приятел
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
