Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Биоинформатика, протоколи, протеини, ДНК, РНК Proteomics

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Начало Биология протоколи Bioinformatic инструменти биология форуми молекулярна биология енциклопедия молекулярна биология изображения Bookmark нас!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php начало> протеин> протеин-протоколи> Западно-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Молекулярна биология Начало Новини науката науката видеоклипове, ДНК, РНК протеин Proteomics изследвания бета! Биоинформатиката Lab оборудване молекулярна биология техники за молекулярна биология продукти и услуги, свързани с биологията Връзки

Molecular Biology Blog Молекулярна биология блог

Send this page to a friend Изпратете страницата на приятел

Intracellular Stations Вътреклетъчна станции

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody, можете да ги зададете на общата буферите буферите азбучен книжарница клетъчна биология и култура гел-електрофореза хистология Microarrays имунология масова спектрометрия микробиология молекулярна изображения пептид Proteomics протеин Microarray чипове PCR в реално време PCR RNAi и Намесвам стъбло килия биология Transfection Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot протоколи

Western Blot Forum Western Blot форум

Western Blot Products Western Blot продукти

Western Blot Books Western Blot книги

Western Blot Troubleshooting Western Blot за отстраняване на проблеми

Western Blot Books Western Blot книги

Western Blotting Protocol Western Blotting Протокол

Western-blot protocol Western blot-протокол

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Подготовка на проби за SDS-PAGE гел-електрофореза от Подготвен Килия Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Подгответе гелове за SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Подгответе 1 x вървят буфер
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Добавете 50 мл на бета-mercaptoethanol до 950 мл проба буфер (за 1 мл). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (само ако не сте пред-бета-mercaptoethanol добавя към пробата буфер)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Добави проба буфер за всяка проба (предварително се определи колко проба можете да заредите с добре - BioRad тънки гребени могат да задържат около 30uL. Големи гребени може accomate до 50uL).
5. Vortex samples briefly. Вихрите проби за кратко.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Poke дупка в капачката на всяка тръба (за предотвратяване на едно от най-сериозните мак при варене)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Варим в блок за отопление и вода в банята (95 ° C) в продължение на 5 минути (по-ниски температури за които е доказано, за предотвратяване на не-специфични протеини агрегация)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel След Изваряване протеин Пробите - Зареждане и стартирате SDS-PAGE Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Центрофуги проби за 1 минута на висока скорост.
2. Load sample into each lane. Зареждане на извадката във всяка алея.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Зареждане MW (молекулно тегло лика) позоваване. (you may want (което може би е добре
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Пусни гел най-100V (100V чрез стифиране гел, напрежението може да бъде увеличена до 200V, когато работи в отделяне на гела с много тичане буфер)

Transfer of Protein Samples to Membrane Прехвърляне на протеини проби мембранни

1. Prepare 1X Transfer buffer Подгответе 1 x Трансфер буфер
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Soak и разклатете гел, в превод на буфер за 15 мин.
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Soak nitrocellulose мембрана (или PVDF) и филтър хартия (екстра дебелина) за няколко минути.
4. Place sandwich on transfer cell: Място сандвич за трансфер клетки:

Extra thick filter paper CLEAR Екстра филтър дебела хартия ЯСНИ
Membrane Мембрана
Gel
Extra thick filter paper BLACK Екстра дебела хартия филтър ЧЕРНО

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Електрически превод: 35V overnite или 90V за 1 час в зависимост от размера на протеини, или ви за търпението!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western Blotting протокол или Immunoblotting

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Подгответе 1 x TBST от запасите решения.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Подгответе блокиране буфер (3% говедата серумния албумин или 5% Blotting клас мляко (Blotto) в TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (можете да опитате няколко различни блокиране на времето и условията).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Измийте мембрана в 1 x TBST с разклащане в продължение на 10 мин..
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Блокиране на стайна температура за 1 час с блокиране на буфер (разклащане или кръгло въртящ)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Incubate ви мембрана (PVDF или nitrocellulose), с основната 1 ° Аб антитяло овърнайт (за трудните условия, blotting т.е. phosphorylation на протеини) или 1 час (лесни условия, като общият белтък) в 4 ° C (overnite) или стайна температура (1 hour инкубация само) покрити с saran обвивам (нежно разклащане). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Можете да използвате пластмасови вани от долар за този магазин (само за употребата на тези blotting!) Пипета или използвайте полето дъна. The dilution for primary antibody is around 1:1000. Като разреждането за първично антитяло е около 1:1000. See manufacturer's instructions. Разглеждане на инструкциите на производителя.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Измийте с 1 x TBST 3 x 15 мин.
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Incubate ви мембрана (PVDF, или nitrocellulose) с вторична антитяло, 2 ° Аб за 30 - 45 мин или (1 час - за трудните условия, blotting) при стайна температура. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Като разреждането за нуждите на средното антитела обикновено е 1:10000 или по-висока. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (т.е. 1uL от средното в 10mL на TBST с мембрана) Виж инструкциите на производителя. Може да искате да добавите вашата антитела към блокиране на решение за намаляване които не са специфични задължителни особено ако получи висока фон в първия си експеримент.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Измийте с TBST 4-5 x 10 мин. This is the most important washing step. Това е най-важна стъпка за измиване.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Излагат на филм. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. Обикновено експозицията време на западната blots е около 10-30 секунди. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Дългосрочни (5-10 минути) за phosphorylation. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Ако имате много слаб сигнал, или имате нужда от повече протеини, за да заредите или се опита да увеличи експозицията време (до 30 минути - можете да опитате да излизат от него по-дълъг касета).
11. Keep your membrane! Съхранявайте вашия мембрана! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Можете да запазите своя мембрана в TBST 1 x в хладилника за известно време. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). Може да се наложи то по следните причини: 1) проверка на натоварването (хартия рецензентите могат да поискат от общото количество протеин или натоварваща стандарт като actin). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. Също така, можете да сонда първоначално за phospho-протеин, а след това ивица и reprobe за общ белтък.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol Също така вижте нашите Западна Blotting мембрана разкомплектоващи Протокол