Welcome to Molecular Station! Добре дошли в молекулярна станция!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Трябва да се регистрирате преди да можете да публикувате на нашите форуми, или да използвате допълнителни функции. Register Now! Регистрирайте се! Its Free and Fast! Тяхното свободно и бързо!

Already registered? Вече сте регистрирани? Login now below. Вход за сега по-долу.

User Name: Име:

Password: Парола:

Remember Me? Запомни ме?

Already registered and Forgot your password? Вече сте регистрирани и Забравили сте паролата си? Click below to recover it. Кликнете по-долу, за да го възстанови.

Recover Lost Password Забравена Забравена парола

Join now - it's fast and free! Присъединете се към момента - това е бързо и безплатно!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Молекулярна станция е най-голямата мрежа от изследователи, учени и любители на науката навсякъде!

Recent Forum Posts Нова Форум постове

Protein Protocols Протеин протоколи

Protein Encyclopedia Протеин енциклопедия

Protein Bioinformatics Протеин Биоинформатика

Protein Science Forum Протеин науката форум

Protein Blog Протеин Blog

DNA News ДНК Новини

Bradford Protein Assay Protocol Брадфорд протеин тест Протокол

Protein Concentration Determinatino using the Bradford Assay Method Протеин концентрация Determinatino използвайки метод на изследване на Брадфорд

Materials for Bradford Assay Материали за изследване на Брадфорд

1. Reagent: The assay reagent is made by dissolving 100 mg of Coomassie Blue G250 in 50 mL of 95% ethanol. Реагент: The тест реактив е направено чрез разтваряне на 100 мг на Coomassie Blue G250 в 50 мл от 95% етанол. The solution is then mixed with 100 mL of 85% phosphoric acid and made up to 1 L with distilled water. Разтворът се смесва с 100 мл 85% фосфорна киселина и се до 1 l с дестилирана вода. The reagent should be filtered through Whatman no. Реагент трябва да бъде филтрирана чрез Whatman не. 1 filter paper and then stored in an amber bottle at room temperature. 1 филтър хартия и след това, съхранявани в една бутилка кехлибар на стайна температура. It is stable for several weeks. Тя е стабилна в продължение на няколко седмици. However, during this time dye may precipitate from solution and so the stored reagent should be filtered before use. Въпреки това, през това време боядисване май утайка от разтвора, така и съхраняваните реагент трябва да бъде филтриран преди употреба.

2. Protein standard . Протеин стандарт. Bovine γ-globulin at a concentration of 1 mg/mL (100 µg/mL for the microassay) in distilled water is used as a stock solution. Говедата γ-глобулин при концентрация от 1 мг / мл (100 μ г / mL за microassay) в дестилирана вода се използва като склад решение. This should be stored frozen at –20oC. Това трябва да се съхраняват замразени най-20oC. Since the moisture content of solid protein may vary during storage, the precise concentration of protein in the standard solution should be determined from its absorbance at 280 nm. От съдържанието на влага в твърди протеин може да варира по време на съхранение, точната концентрация на протеини в стандартен разтвор трябва да се определя от нейната absorbance на 280 мм. The absorbance of a 1 mg/mL solution of γ-globulin, in a 1-cm light path, is 1.35. В absorbance от 1 мг / мл разтвор на γ-глобулин, в 1-см светлината пътя, е 1,35. The corresponding values for two alternative protein standards, bovine serum albumin and ovalbumin, are 0.66 and 0.75, respectively. Съответните стойности за две алтернативни протеин стандарти, от рода на едрия рогат серумния албумин и яйчен албумин, са 0,66 и 0,75 съответно.

3. Plastic and glassware used in the assay should be absolutely clean and detergent free. Пластмасови изделия и използвани в анализ трябва да бъде абсолютно чиста и миещи безплатно. Quartz (silica) spectrophotometer cuvettes should not be used, as the dye binds to this material. Кварц (силициев двуокис) Спектрофотометър cuvettes не трябва да се използва, тъй като боядисване се свързва с този материал. Traces of dye bound to glassware or plastic can be removed by rinsing with methanol or detergent solution. Следи от боядисване длъжни да стъклени или пластмасови могат да бъдат извадени от изплакване с метанол или миещ разтвор.

Standard Bradford Assay Method Стандартен метод за изследване на Брадфорд

1. Pipet between 10 and 100 µg of protein in 100 µL total volume into a test tube. Pipet между 10 и 100 μ грама на протеин в 100 μ L общия обем на тест тръба. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Ако се сближат проба концентрация е известно, тест набор от разтвора (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepare duplicates of each sample. Подгответе дубликати на всяка проба.

2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 1 mg/mL γ-globulin standard solution into test tubes, and make each up to 100 µL with distilled water. За калибрационната крива, pipet дубликат обеми 10, 20, 40, 60, 80 и 100 μ L от 1 мг / мл γ-глобулин стандартен разтвор в теста тръби, и да направи всеки до 100 μ L с дестилирана вода. Pipet 100 µL of distilled water into a further tube to provide the reagent blank. Pipet 100 μ L дестилирана вода в тръбата, да предостави допълнително реактив празно.

3. Add 5 mL of protein reagent to each tube and mix well by inversion or gentle vortexmixing. Добави 5 мл на протеини реактив за всяка тръба и смесват добре с инверсия или нежно vortexmixing. Avoid foaming, which will lead to poor reproducibility. Избягвайте образуването на пяна, което ще доведе до лоши възпроизводимост.

4. Measure the A595 of the samples and standards against the reagent blank between 2 min and 1 h after mixing. Измерване на A595 на пробите и стандарти срещу реактив празно между 2 мин и 1 ч след смесване. The 100 µg standard should give an A595 value of about 0.4. В μ 100 грама стандарт трябва да даде A595 на стойност около 0,4. The standard curve is not linear, and the precise absorbance varies depending on the age of the assay reagent. Стандартната крива не е линейна, както и точната absorbance варира в зависимост от възрастта на тест реагент. Consequently, it is essential to construct a calibration curve for each set of assays. Следователно, това е от съществено значение за изграждане на калибриращата крива за всеки набор от тестове.

Microassay Method This form of the assay is more sensitive to protein. Microassay Метод Тази форма на тест е по-чувствителни към протеини. Consequently, it is useful when the amount of the unknown protein is limited (see also Note 9). Следователно, това е полезно, когато размерът на Незнайния протеин е ограничена (виж също бележка 9). 1. Pipet duplicate samples containing between 1 and 10 µg in a total volume of 100 µL into 1.5-mL polyethylene microfuge tubes. Pipet дублирани проби, съдържащи между 1 и 10 грама по-μ с общ обем от 100 μ L под 1,5 мл microfuge полиетиленови тръби. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Ако се сближат проба концентрация е известно, тест набор от разтвора (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 100 µg/mL γ-globulin standard solution into microfuge tubes, and adjust the volume to 100 µL with water. За калибрационната крива, pipet дубликат обеми 10, 20, 40, 60, 80 и 100 μ L на 100 μ г / mL γ-глобулин стандартен разтвор в microfuge тръби, и да коригирате обем до 100 μ L с вода. Pipet 100 µL of distilled water into a tube for the reagent blank. Pipet 100 μ L дестилирана вода в тръбата за реагент празно.

3. Add 1 mL of protein reagent to each tube and mix gently, but thoroughly. Добавете 1 мл на протеини реактив за всяка тръба и микс внимателно, но задълбочено.

4. Measure the absorbance of each sample between 2 and 60 min after addition of the protein reagent. Измерване на absorbance на всяка проба между 2 и 60 мин след добавянето на протеин реагент. The A595 value of a sample containing 10 µg γ-globulin is 0.45. В A595 стойност на една проба, съдържаща 10 грама γ μ-глобулин е 0,45.

see also: Bradford Protein Assay Вижте също: Брадфорд протеин тест

References for Bradford Assay Препоръки за изследване на Брадфорд

Modified from protocol by Nicholas J. Kruger. Изменено от Протокола от Никълъс J. Kruger.

Related Protein Concentration Articles Свързани протеин концентрация на членове

Protein Concentration Протеин Концентрация

Protein Concentration Protocol Протеин концентрация Протокол

Lowry Protein Assay Lowry протеин тест

Lowry Method Protocol Lowry метод Протокол

Bradford Method Брадфорд Метод

Other Protein Methods: Други протеини методи:

Western Blot Western Blot

Immunoprecipitation Immunoprecipitation