home > protein-microarrays > protein-chip-detection > index.php начало> протеин-microarrays> протеин чип откриване> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  |  |
|---|---|---|---|---|---|
Protein Array Protocols Протеин множество протоколи | Protein Array Bioinformatics Протеин масив Биоинформатика | Learn about Protein Arrays Научете повече за протеин масиви | Protein Array Kits and Products Протеин масив комплекти и продукти | Protein Array Forum Протеин масив форум | Proteomic News Proteomic Новини |
Protein and Antibody Microarrays Протеин и антитела Microarrays
Detection Methods and Non-specific Binding Методите за откриване и Не-специфичен обвързващ
Non-specific binding to the array needs to be minimized and this is typically done by immersing the arrays in a bovine serum albumin based buffer (BSA) (31). Не-специфични задължителни за масив трябва да бъде сведено до минимум и това обикновено се извършва от immersing на масиви в говежди серум албумин, базирани буфер (BSA) (31).
Analyte-binding and retention on protein arrays proceeds via thermodynamically driven binding mechanism similar to the hybridization of nucleic acid targets to probes. However, the detection of bound targets to proteins is considerably more complex than that of DNA microarray detection (9). Currently a variety of detection methods are being examined. For example, ELISA was first used to detect proteins for both filter arrays (66,67) and glass arrays (68). Аналитичен задължителен характер и съхраняването на протеин масиви приходите чрез thermodynamically управляван задължителен механизъм, подобен на хибридизация на Нуклеинова киселина цели за вероятно. Все пак, откриване на цели, обвързани с протеини е значително по-сложен от този на ДНК microarray откриване (9). Момента е разнообразието на методите за откриване са проверени. Така например, ELISA за първи път е използвана за откриване на протеини и за двете филтър масиви (66,67) и стъклени масиви (68). ELISA based detection methods have the disadvantage of non-specificity of protein-antibody interactions, leading to many false positives. Radioisotope labeling was used by Ge et al. (22), radioisotope labeling to study protein–protein, protein–DNA, protein–drug interactions on filter arrays. Zhu et al. used radioisotope labeling to conduct kinase assays of different substrates by using purified yeast kinase proteins on a array (36). The preferred method of detection is fluorescence detection because these methods are generally safe, extremely sensitive, simple and can have very high resolution. These detection methods are also compatible with standard microarray scanners. ELISA базирани методи на откриване е в ущърб на неспазване на спецификата на протеин-антитяло взаимодействия, които водят до много фалшиви положителен. Radioisotope етикетиране бе използван от Ге и др. (22), radioisotope етикетиращи да учат протеин-протеин, протеини-ДНК, протеини - лекарствени взаимодействия на филтъра масиви. Жу и др. използвани radioisotope етикетиране киназа да проведе тестове на различни субстрати чрез използване на пречистената дрожди киназа протеини на масив (36). Предпочитаната метод за откриване е флуоресценция за откриване, тъй като тези методи обикновено са безопасни, изключително чувствителна , Прости и могат да имат много висока разделителна способност. Тези методи за детекция също са съвместими със стандарта microarray скенери. Generally, a chip is either directly probed with a fluorescent molecule (eg a fluorescently labeled protein or small molecule, by using a tagged probe (eg biotin), which can then be detected in a second step using a fluorescently labeled affinity reagent (eg streptavidin) (16,56). Another fluorescent labeling method is rolling circle amplification (RCA), which is also extremely sensitive (32). Като цяло, един чип е пряко вероятно с флуоресцентни молекула (напр. една fluorescently означени с белтък или малка молекула, с помощта на маркирани проби (напр. biotin), които могат да бъдат открити във втора стъпка чрез fluorescently означени с афинитет реагент (например streptavidin ) (16,56). Флуоресцентни етикетиране Друг метод е подвижния кръг усилвателя (RCA), което също е изключително чувствителна (32).
Although the proteomes under comparison can be labeled in a comparable fashion with fluorophores, the reproducibility of these chemical reactions is poor and interference with the protein-antibody interactions presents an additional complexity (9). Въпреки че proteomes в сравнение могат да бъдат означени по начин, сравним с fluorophores, на възпроизводството на тези химични реакции е лошо и намеса в протеин-антитяло взаимодействия представя допълнителна сложност (9). Also, non-uniform labeling of proteins can be addressed by performing a dual-colour ratiometric assay, where an internal standard is present for each target protein which is measured (9). Също така, не са единни етикетиране на протеини могат да бъдат разгледани от изпълнение на стоки с двойна употреба, цвят ratiometric анализ, когато е вътрешен стандарт се представя за всеки протеин, който се измерва (9). A disadvantage of labeling proteins with fluorophores is a reduction of the quantitative accuracy of the assay, as incorporation of the label may alter the binding properties of the proteins (9). Недостатък на етикетиране на протеини с fluorophores е намаляване на количествените точността на тест, тъй като включването на етикета може да промени задължителен свойства на протеини (9).
Although direct protein labeling detection methods are still widely used, the intrinsic problems mentioned has resulted in the increasing use of label free detection methods for protein microarrays. These methods are mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (AFM) (70), and surface plasmon resonance (SPR) (71). Въпреки че директните методи за откриване на протеин, етикетиране, са все още широко използвани, присъщите проблеми, споменати доведе до увеличаване на употребата на етикети безплатно откриване на методи за протеин microarrays. Тези методи са масова спектрометрия (MS), ЯДРЕНА МИКРОСКОПИЯ (AFM) (70), и площ plasmon резонанс (SPR) (71).
Non-labeling methods have advantages as a direct detection approach for antibody microarrays since labeling molecules affects protein activity. Не-етикетиране методи имат предимства като директен подход за откриване на антитела microarrays етикетиране молекули, тъй като засяга протеин дейност. SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) mass spectrometry has been used to detect low-density arrays of captured proteins (69). SELDI (площ с усилена лазерни десорбция / йонизация) масова спектрометрия е била използвана за откриване на ниска плътност масиви на заловен протеини (69). Proteins are captured on a metal surface array (SELDI protein array) and are vapourized using a laser beam. Analysis using mass spectrometry data is then performed in order to reveal the identities of these proteins. Протеини са заловени по незалепващо покритие масив (SELDI протеин масив) и са vapourized използвайки лазерен лъч. Анализи, използвайки масови спектрометрия данни се извършва с цел да се разкрие самоличността на тези протеини.
Atomic force microscopy (AFM) method uses surface topological changes to identify the captured proteins on an antibody array (70). ЯДРЕНА МИКРОСКОПИЯ (AFM) метод използва площ топологично промени, за да се идентифицира заловен протеини на антитела масив (70). When rabbit IgG is immobilized on a gold surface and binds to its complimentary antibodies, goat ant-rabbit IgG, AFM detects the increase in height, and thus is able to measure binding interactions. However in order to study the kinetics of antigen–antibody interactions, real-time detection methods will be useful. При зайци IgG не е в движение по повърхността на златото и се свързва с неговото съобщение антитела, козе Мравки-заешко IgG, AFM разпознава увеличаването на височината, и по този начин е в състояние да задължителна мярка взаимодействия. Въпреки това, с цел да изследва кинетиката на антиген-антитяло взаимодействия , В реално време, методите за откриване ще бъде от полза. Surface plasmon resonance (SPR) has matured into a versatile detection tool to study the kinetics of receptor–ligand interactions with a wide range of molecular weights, affinities and binding rates (72-74). Повърхностни plasmon резонанс (SPR) е узряло в инструмент за откриване на гъвкави проучване Кинетиката на рецептор-лиганд взаимодействие с широк спектър от молекулните тегла, ориентация и задължителни курсове (72-74). Commercial SPR chips are available however their detection resolution is limited. A sensor surface with 64 individual immobilization sites in a single flow cell was developed (75). An antibody array biosensor was also developed to study the kinetics of antigen binding using a planar waveguide as the detection method. Търговско SPR чипове са на разположение обаче им откриване на резолюцията е ограничена. Сензор с площ 64 индивидуални обездвижване сайтове в един поток клетка е разработена (75). Антитялото масив biosensor също беше разработен да изследва кинетиката на антигени задължително използването на планарни, както Вълновод на метод за откриване. Using this method, the group demonstrated that significant signal intensity could be achieved from spots as small as 200 mm in diameter. Използвайки този метод, групата показа, че значителна интензивност на сигнала може да бъде постигната от петна, като малки по 200 мм в диаметър. It is therefore expected that this approach will be suitable for high-throughput and parallel kinetics studies. Следователно се очаква, че този подход ще бъде подходящ за висока производителност и кинетика паралелни проучвания. (76).
Range of Detection Обхват на детекция
Another difference between protein and DNA microarrays is that protein concentrations in a single biological sample or cells are several orders of magnitute greater than that for mRNAs. Thus protein chip detector systems must have a very large range of detection operation – up to a factor of 1014, compared to 104 for mRNA. Thus an antibody with nanomolar affinity to a particular target will be saturated by the presence of this target at micromolar concentrations and will fail to detect pico- or femtomolar target levels. Thus accommodating rare and abundant proteins will probably require separate arrays (7,8,9). Друга разлика между протеини и ДНК microarrays е, че концентрациите протеин в една биологична проба или клетки са няколко заповеди на magnitute по-голяма от тази за mRNAs. Така протеин чип детектор системи трябва да имат много голям набор от откриване на операцията - до фактор за 1014 , В сравнение с 104 за mRNA. Така антитяло с nanomolar афинитет към определена цел ще бъде наситен с присъствието на тази цел в micromolar концентрации и ще успеят да открият Пико или femtomolar целеви нива. По този начин се настаняват редки и богат на протеини вероятно ще изискват отделни масиви (7,8,9).
Multiple antibodies with varying affinities for the target may be positioned at different areas of the array however studies have shown that only 20% of arrayed antibodies provide measurements of proteins at low concentrations (33). Много антитела с различна ориентация за целта могат да бъдат разположени в различни райони на множество проучвания обаче показват, че само 20% от подредена антитела осигуряват измервания на протеини при ниски концентрации (33).
Next: Protein Production for Protein Arrays Следваща: протеин за производство на протеин масиви
References for Protein and Antibody Microarrays Препратки за протеин и Antibody Microarrays
Back to: Връщане:
Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. Въведение и на фона на протеини чипове и Antibody Чипове.
Types of Antibody and Protein Chips Видове на антитела и протеини Чипове
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Отговорности / Условия за ползване | Поверителност | © 2005-2007 молекулярна Station.com, Всички права запазени.
Send this page to a friend Изпратете страницата на приятел
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
