Welcome to Molecular Station! Добре дошли в молекулярна станция!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Трябва да се регистрирате преди да можете да публикувате на нашите форуми, или да използвате допълнителни функции. Register Now! Регистрирайте се! Its Free and Fast! Тяхното свободно и бързо!

Already registered? Вече сте регистрирани? Login now below. Вход за сега по-долу.

User Name: Име:

Password: Парола:

Remember Me? Запомни ме?

Already registered and Forgot your password? Вече сте регистрирани и Забравили сте паролата си? Click below to recover it. Кликнете по-долу, за да го възстанови.

Recover Lost Password Забравена Забравена парола

Join now - it's fast and free! Присъединете се към момента - това е бързо и безплатно!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Молекулярна станция е най-голямата мрежа от изследователи, учени и любители на науката навсякъде!

Recent Forum Posts Нова Форум постове

PCR Protocols PCR протоколи	PCR Bioinformatics and Databases PCR биоинформатиката и бази данни	Learn about PCR Научете повече за PCR	PCR Kits and Products PCR комплекти и продукти	PCR Forum PCR форум	PCR Books PCR Книги

Successful PCR Conditions Успешно PCR условия

Parameters for Successful PCR Параметри за успешно PCR

Are you having problems of achieving a successful PCR?  Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.  Also Thermal Cycling Considerations:  PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. Имате проблеми за постигане на успешен PCR? Много фактори могат да повлияят на вашите резултати от вашите PCR, като например: Метална Йон Cofactors, субстрат и субстрат Analogs, буферите и соли и Cosolvents. Също така Thermal Колоездене съображения: PCR Корабите, температура и време за оптимизация, PCR амплификация цикли, Ензим / target и топла старт.

Metal Ion Cofactors and PCR Метални Йон Cofactors и PCR

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.  Its concentration must be optimized for every primer:template system. Важен cofactor за ДНК полимеразноверижна в PCR е магнезиев хлорид. Неговата концентрация трябва да бъде оптимизирана за всеки първи: шаблон система. Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. Много от компонентите на реакцията обвърже магнезиев йон, включително и грундове, шаблон, PCR продукти и dNTPs. The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. Основната 1:1 задължителен агент, за магнезиев йон е висока концентрация на dNTPs в реакция. Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. Поради това е необходимо за свободна магнезиев йон да служи като един ензим cofactor в PCR, общият магнезиев йон концентрация трябва да надхвърля общата dNTP концентрация. Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. Обикновено, за да започне оптимизиране на процеса, 1,5 мм магнезиев хлорид се добавя към PCR в присъствието на 0,8 мм общо dNTPs. This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. Това оставя около 0,7 мм свободна магнезий за ДНК полимеразноверижна. In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. По принцип, магнезиев йон трябва да се променя в концентрация серия от 1.5-4.0 мм 0,5 мм стъпки.

Substrates and Substrate Analogs for PCR Субстрати и субстрат Analogs за PCR

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.  They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. ДНК полимеразите включи много ефективно dNTPs. Те също така могат да включват промяна субстрати, когато те се използват като допълнителни елементи в PCR. Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. Примери на субстрати, използван за ДНК полимеразноверижна са: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP и fluorescently надписани dNTPs. For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. За обикновените PCR, концентрацията на dNTPs остава балансиран в equimolar съотношения, например, 200 μ M всеки dNTP. Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. Също така имайте предвид, че, отклонения от тези стандартни препоръки могат да бъдат полезни в някои amplications. For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. Така например, когато случайно мутагенеза на специфична цел е желана, небалансирани dNTP концентрации насърчаване на по-висока степен на misincorporations от ДНК полимеразноверижна.

Buffers and Salts for PCR Буферите и соли за PCR

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. В зависимост от ДНК полимеразноверижна използват оптимално PCR буфер концентрация, концентрация на сол, както и на рН трябва да се бере съответно на ДНК, полимеразноверижна. The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. В PCR буфер за Taq ДНК полимеразноверижна се състои от 50 мм и 10 мм KCl три-HCl, рН 8,3, при стайна температура. This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. Този буфер дава йонни здравина и буферен капацитет, необходими по време на реакция. It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. Важно е да се отбележи, че концентрацията на сол се отразява на ТМ на първия: шаблон за дуплекс, а оттам и на annealing температура.

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. Различни PCR Cosolvents са използвани за увеличаване на добива, ефикасност, както и спецификата на PCR amplifications. These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. Тези cosolvents могат да бъдат изгодни в някои amplifications, както и в други неблагоприятни amplifications. It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. Е невъзможно да се предскаже добавка, която ще бъде полезна за всеки първи: шаблон за дуплекс и затова cosolvent трябва да бъдат изследвани емпирично за всяка комбинация.

Thermal Cycling Considerations Thermal колоездене съображения

PCR Vessels PCR Кораби

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. PCR трябва да се извършва в съдове, които са съвместими с ниски суми на ензима и Нуклеинова киселини, и че имат добри Термо-трансферни характеристики. Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. Обикновено, полипропилен се използва за PCR кораби и обикновени, с дебелина оградените microcentrifuge тръби са избрани за много термални cycler системи. PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. PCR е най-често изпълнявани по 10-100 μ L реакция изисква от мащаба и превенцията на изпарение / кондензация процеси в закрити реакция топлинна тръба по време на каране на велосипед. A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. А минерално масло или овърлей восъчен слой служи тази цел. More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. В последно време, 0.2 мл тънки оградените кораби са оптимизирани за PCR процес и масло без термична cyclers са проектирани, че използването на разгорещени обхваща над тръби провежда в рамките на извадката блок.

Temperature and Cycle Time Optimization Температура и време, оптимизиране на цикъла

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. Съществено е, че реакцията смеси достигне денатурация, annealing, както и разширяване температури във всеки топлинен цикъл. If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. Ако притежава достатъчно време, е определено по всяко температура, температурата на пробата няма да equilibrated с тази на пробата блок. Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. Някои от термични cycler дизайни време на очакване интервал на базата на блок температура, докато други база трюма време на прогнозната проба температура. If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. Ако обикновените дебела оградените тръби, използвани в cycler контролирани от блок температура, 60-и задръжте време е достатъчно за equilibration. Extra time may be recommended at the (72°C) extension step for longer PCR products. Допълнително време, могат да бъдат препоръчани най-(72 ° C) разширение стъпка за по-дълъг PCR продукти. Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. Използването на тънка оградените 0,2 мл тръба в cycler контролирани от прогнозната проба температура, само на 15 и е задължително. To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. За да използвате съществуващите протоколи или за развитие на протоколи за използване на множество лаборатории, че е много важно да изберете проведе пъти в зависимост от cycler дизайн и дебелина на стената тръба.

PCR Amplification Cycle Number PCR амплификация цикъл броя

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. Броят на PCR амплификация цикли, трябва да бъдат оптимизирани по отношение на началната концентрация на целева ДНК. It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. Препоръчително е, че от 40 - 45 цикъла да се разширят 50 целева молекули, и 25-30 цикъла да се разширят 3 × 105 молекули с една и съща концентрация. This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. Това не-пропорционалност е предизвикано от т. нар. ефект плато, в което намаление в размер изразител на продукта натрупване се случва в късните стадии на PCR. This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. Това може да бъде причинено от разграждането на reactants (dNTPs, ензим); reactant слой (грундове, dNTPs); крайния продукт инхибиране (пирофосфат формация); конкурс за reactants от които не са специфични продукти, или на конкуренцията за първи задължителен от reannealing на концентрирана ( 10 nM) продукт. It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. Той обикновено е препоръчително да работите с минимален брой цикли, необходими, за да видите конкретните желания продукт, защото нежеланите nonspecific продукти ще се намесва, ако броят на циклите е прекалено.

Enzyme / Target Ензим / target

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. В стандартен аликвот на Taq ДНК полимеразноверижна използва за 100 - μ L реакция, има около 1010 молекули. Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. PCR Всяка проба трябва да бъде оценена за броя на копията цел тя съдържа или може да съдържа. For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. Така например, от 1 на ламбда ДНК съдържа 1,8 × 107 копия. For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. За ниско-вход копие номер PCR, ензимът става ограничаване и е необходимо да се даде на процеса на разширяване увеличава повече време. Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. Thermal cyclers могат надеждно да изпълнява тази автоматична сегмент разширяване процедура, за да увеличите добивите PCR.

Hot Start Conditions Горещи проекта условия

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. Всички посочени по-горе оптимизации, също се прилага по отношение на PCR, който е предназначен, от самото начало, с гореща проекта метод. Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. Често, гореща на проекта може да се включи успешно в PCR преди оптимизирана, без да се променя реакцията условия. However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. Въпреки това, той обикновено се плаща за reoptimize след добавяне на горещо на проекта. Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. Оптимизация често е баланс между производство на продукта, колкото е възможно и overproducing nonspecific, фон amplifications. Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. Защото горещо на проекта значително намалява фон amplifications, горните ограничения са повдигнати при условия, като например концентрацията ензим, цикъл на брой, и метални йони cofactor концентрация. Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. Чувствителна PCRs, които са били силно мелодия без топла проекта май, когато не успеят горещо на проекта се добавя. This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. Това може да бъде причинено от леко забавяне в началото на цикъла, причинени от смесване или активиране на ензима. The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. В PCR обикновено могат да бъдат възстановени, често пъти със значително увеличаване на броя на конкретен продукт, само чрез повишаване на параметрите или ограничаване на реагентите. In addition, there are optimizations specific to each hot start method. В допълнение, има оптимизации, специфични за всяка гореща проекта метод. Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. Смесване или активиране на ензима могат да бъдат засегнати от PCR обем, буферни състав и рН, cosolvents, колоездене условия, и така нататък. The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. Конкретните продукта литература, което често е продукт, вмъквам, следва да бъде консултиран за информация по тези съображения.