home > pcr > history-of-pcr > index.php начало> pcr> История на pcr> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  | |
|---|---|---|---|---|---|
PCR Protocols PCR протоколи | PCR Bioinformatics and Databases PCR биоинформатиката и бази данни | Learn about PCR Научете повече за PCR | PCR Kits and Products PCR комплекти и продукти | PCR Forum PCR форум | PCR Books PCR Книги |
Also visit PCR Station Също посещение PCR станция
Copyright 2006 MolecularStation Copyright 2006 MolecularStation
Polymerase Chain Reaction - PCR Полимеразноверижна реакция - PCR
Table of Contents : Таблица Съдържание:
Introduction to PCR - Polymerase Chain Reaction Въведение в PCR - полимеразноверижна реакция
Polymerase Chain Reaction (PCR) Полимеразноверижна реакция (PCR)
PCR, a Concept to be Discovered PCR, концепция да бъде Откривател
General Principles of the PCR Общите принципи на PCR
Polymerases/Reaction Specificity and Efficiency Полимерази / реагиране специфичност и ефективност
Utility of PCR Помощната програма на PCR
PCR and Molecular Cloning PCR и молекулярна клониране
Misincorporation: Errors of In Vitro Systems Misincorporation: Грешки на ин витро системи
Reaction Specificity Реакция Специфичност
Major Advantages of PCR as a Cloning Method include its Rapidity, Sensitivity, and Robustness Основни предимства на PCR като Клонираща метод включва бързина, чувствителността и Robustness
Limitations of PCR Ограничения на PCR
Instruments for PCR Актове за PCR
Oligonucleotide Synthesis Oligonucleotide Синтез
Will PCR ever be replaced? Ще PCR някога да се замени? – Helicase-dependent Amplification (HDA) -- Helicase зависими от усилвателя (HDA)
More than 30 years ago, the introduction of recombinant DNA technology as a tool for the biological sciences revolutionized the study of life. Molecular cloning allowed the study of individual genes of living organisms; however this technique was dependent on obtaining a relatively large quantity of pure DNA. This depended on the replication of the DNA of plasmids or other vectors during cell division of microorganisms (1). Researchers found it extremely laborious and difficult to obtain a specific DNA in quantity from the mass of genes present in a biological sample (2). Recombinant DNA technology made possible the first molecular analysis and prenatal diagnosis of several human diseases. Fetal DNA obtained by amniocentesis sampling could be analyzed by restriction enzyme digestion, electrophoresis, southern transfer and hybridization to a cloned gene or oligonucleotide probes (3). However, southern blotting permitted only rudimentary mapping of genes in unrelated individuals (4). Повече от 30 години, въвеждането на рекомбинантна ДНК технология като инструмент за биологични науки revolutionized изследването на живота. Молекулярна клониране допуска проучване на отделни гени на живите организми, но тази техника е била зависима от получаване на относително голямо количество чист ДНК. Това зависи от репликация на ДНК на плазмиди или други носители, през клетъчната разделение на микроорганизми (1). Изследователи установено, че е изключително труден и трудно да се получи специална ДНК в количество от масата на гени, присъстващи в една биологична проба (2 ). Рекомбинантна ДНК технология прави възможно първото молекулярно prenatal анализ и диагностика на няколко човешки болести. Плода, получени от ДНК проби amniocentesis биха могли да бъдат анализирани чрез ограничаване ензим храносмилането, електролиза, южна трансфер и хибридизация на клонирани гени и oligonucleotide вероятно (3). Въпреки това южната blotting разрешено само недоразвит картиране на гените на несвързани лица (4).
PCR, an acronym for Polymerase Chain Reaction (5,6), allowed the production of large quantities of a specific DNA from a complex DNA template in a simple enzymatic reaction. PCR is a recently developed procedure for the in vitro amplification of DNA. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the manipulation of DNA fragments may be performed as a results of its simplicity and usefulness (7). PCR, акроним полимеразноверижна реакция (5,6), позволява производството на големи количества на определен комплекс от ДНК с ДНК шаблон по прост ензимна реакция. PCR е наскоро разработи процедура за ин витро амплификация на ДНК. PCR трансформира начина, по който почти всички изследвания, изискващи манипулиране на ДНК фрагменти могат да бъдат изпълнени като резултатите от своята простота и полезността (7).
In the 1980s, Kary Mullis (Figure 1) and a team of researchers at Cetus Corporation at Cetus Corporation conceived of a way to start and stop a polymerase's action at specific points along a single strand of DNA. Mullis also realized that by harnessing this component of molecular reproduction technology, the target DNA could be exponentially amplified. This DNA amplification procedure was based on an in vitro rather than an in vivo process (5,6,8). Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for cloning, analyzing, and modifying nucleic acids (1). Previous techniques for isolating a specific piece of DNA relied on gene cloning – a tedious and slow procedure. PCR, on the other hand Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want” (2,8). През 1980 г., Kary Mullis (графика 1) и екип от изследователи в кит Corporation най-кит Corporation замислена от начин да започнат и да спрат един полимеразноверижна на действие на специфичните точки по една нишка от ДНК. Mullis също така разбрах, че чрез улавяне на този компонент възпроизвеждане на молекулярната технология, целта на ДНК може да бъде експоненциално задълбочени. ДНК амплификация Тази процедура се базира на една ин витро, а не живея в един процес (5,6,8). Cell-свободно ДНК амплификация чрез PCR бе в състояние да се опрости много от стандартните процедури за клониране, анализиране и модифициране Нуклеинова киселини (1). Предишна техники за изолиране специфична част от ДНК, на ген клонирането - един tedious и бавна процедура. PCR, от друга страна Кери заяви, Mullis "ви позволява да изберете част от ДНК, които ви интересуват, както и да имат по-голяма част от нея, колкото искате "(2,8). When other Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing essentially unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their work (8). Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992 (1). Furthermore, the large number of publications of course makes it impossible to review all the important contributions to the development and application of PCR technology; however we will attempt to review here the most important developments in the practice of basic PCR. При друг кит учени в крайна сметка успя да печелите полимеразноверижна реакция изпълнява желания, както по надежден начин, те имат изключително мощен метод за предоставяне по същество неограничени количества на точни генетичен материал, молекулярната биолози и други, необходими за тяхната работа (8). Тъй като Първият доклад in1985, повече от 5000 научни статии са публикувани от 1992 г. (1). Нещо повече, голям брой публикации, разбира се го прави невъзможно да се преглеждат всички важни принос за развитието и прилагането на PCR технология, но ние ще се опитаме да преразгледа тук най-важните промени в практиката на основния PCR.
PCR was thought to be conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA. However, some pioneering work was also done by Gobind Khorana in 1971 who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers. Progress then was limited by primer synthesis and polymerase purification issues (9). In Mullis’s head, the invention grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 109 base pairs). Thus, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later however, this second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was modified by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even further. Repeating the steps would enable the products of the first round to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the cycle again would result in four copies, et cetera . Several weeks passed before this great idea was attempted (8). Two primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human b-globin gene, the amplification was performed, and the products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology (5,6). PCR е мисълта да бъде замислена от д-р Кери Mullis през 1983 г., докато работите в кит Corporation в Emeryville, CA. Все пак, някои инициатор работа също бе извършена от Gobind Khorana които през 1971 г., описани основен принцип на Пресъздаване част от ДНК, като се използват две грундове. прогрес, тогава е бил ограничен от първия синтез и пречистване на полимеразноверижна проблеми (9). Mullis В главата, изобретението е нараснал от теоретичната схема, да изпълнява ограничени dideoxynucleotide секвениране на уникалните човешки гени при използване на синтетичен oligonucleotides за целите на общата човешка диагностициране на заболяването мутации. очевидна пречка за такава директна секвениране стратегия е висока сложност на генома на човека (3,3 X 109 базови двойки). Така, второ или първо oligonucleotide е добавен в блок на развитието на синтеза на първото първо. По-късно обаче , Това е включено второто първо да се свърже с друга нишка ДНК, така че всяка нишка на мутант алела би допринесло за евентуален сигнал. Ако тази схема, включваща едновременно хибридизация на грундове за всяка нишка е бил модифициран чрез нагряване смес и след това се повтарят на annealing и разширяване стъпки, а след това основният сигнал ще се увеличи още повече. Повтарящ стъпки ще даде възможност на продуктите, на първия тур да се дублира във втория цикъл, за да добива две копия. Повтарящ цикъл отново ще доведе в четири екземпляра, ет. cetera. няколко седмици, преди да премина тази голяма идея беше опита (8). грундове Две са синтезирани да бъде перфектно допълнение към всеки край на 110 базова двойка регион на клонирани сегмента на човека б-globin ген, на усилвателя е била изпълнена, и продуктите са били идентифицирани от акриламид гел-електрофореза. Крайният резултат е очакваната 110 базова двойка ДНК фрагмент и началото на PCR като основен метод в молекулярната биология (5,6).
In Mullis's original PCR process(5,6,8), the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). В Mullis на първоначалния процес на PCR (5,6,8), ензимът е бил използван в ин витро (в контролирана среда извън организъм). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. Двойните-блокирани ДНК бе разделена на две единични снопчета от отопление, че до 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. В тази температура, обаче, Д. coli, полимеразноверижна ДНК бе унищожена, така че ензим, трябваше да се попълва след отопление етап на всеки цикъл. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis на оригинала PCR процес беше много неефективни, тъй като той изисква голяма доза от време, огромното суми на ДНК-полимеразноверижна, както и непрекъснатите грижи в цялата PCR процес.
Examination of the PCR amplification mechanism reveal its simplicity but also its elegance (Figure 2). Oligonucleotide primers are first designed to be complementary to the ends of the sequence to be amplified, and then mixed in molar excess with the DNA template and deoxyribonucleotides in an appropriate buffer. Following heating to denature the original strands and cooling to promote primer annealing, the oligonucleotides each bind to a different strand of the target fragment. The primers are positioned so that when each is extended by the action of a DNA polymerase, the newly synthesized strands will overlap the binding site of the opposite oligonucleotide. As the process of denaturation, annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new copies of DNA (Figure 3). The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance of 2n, where n is the number of cycles (1,7,13). Проверка на PCR амплификация механизъм разкрива своята простота, но също така своята елегантност (Фигура 2). Oligonucleotide грундове са предназначени да бъдат първи в допълнение към края на редицата да бъде разширена, а след това смесват в моларен излишък с ДНК шаблон и deoxyribonucleotides в подходящ буфер. отопление за денатуриране След първоначалното направления и охлаждане за насърчаване на първия annealing, на oligonucleotides всеки свързва с различна нишка на целевите фрагмент. За грундове са разположени така, че когато всеки е удължен с действието на ДНК, полимеразноверижна, новосъздадените синтезиран направления ще се застъпва на мястото за свързване на противоположните oligonucleotide. Тъй като процесът на денатурация, annealing, и полимеразноверижна разширяване продължи грундове многократно името на двете оригиналната ДНК шаблон и допълнителни обекти в новосъздадения синтезиран направления и са удължени за производството на нови копия на ДНК (Фигура 3). Крайният резултат е изразител увеличение в общия брой на ДНК фрагменти, които включват в редиците между PCR грундове, които са представени най-сетне теоретична изобилието от 2n, където е н е броят на циклите (1 , 7,13).
A DNA polymerase is a naturally occurring enzyme, a biological macromolecule that catalyzes the formation and repair of DNA. А ДНК полимеразноверижна е естествен вид ензим, биологичен макромолекула, че catalyzes формирането и ремонт на ДНК. It works by binding to a single DNA strand and creating a complementary strand. Тя работи със задължителен за една нишка ДНК и създаването на допълнителни нишка. The accurate replication of all living matter depends on this activity, where it functions to duplicate DNA when cells divide (10,11). Only recently have scientists learned to manipulate this activity and apply it to scientific research. The earliest PCR experiments utlilized the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at a temperature of 37C to amplify specific targets from human genomic DNA (5,6). Often these PCR reactions produced incompletely pure target product as judged by gel electrophoresis (1). These initial PCR amplifications with the Klenow fragment were not highly specific (5,6). Although a unique DNA fragment could be amplified ~200,000 fold from genomic DNA, only about 1% of the PCR product was the targeted sequence (13). A specific hybridization probe was required to analyse the amplified DNA (5,6). Точно репликация на живата материя зависи от тази дейност, а когато се дублират функции на ДНК, когато клетките се делят (10,11). Учени едва наскоро са научили да манипулират тази дейност и да го прилагат научни изследвания. Първите опити PCR utlilized на Klenow Фрагмент от Escherichia коли ДНК полимеразноверижна I при температура от 37 до разширят специфични цели от човешка ДНК genomic (5,6). PCR Често тези реакции, произведени недостатъчно чист продукт, като целта определено от гел-електрофореза (1). PCR тези първоначални amplifications с Klenow фрагмент не са много конкретни (5,6). Макар и уникален фрагмент ДНК може да бъде разширена ~ 200000 пъти от genomic ДНК, само около 1% от PCR продукт беше насочена последователност (13). Определена хибридизация на проби е необходимо да анализира задълбочени ДНК (5,6).
Some PCR conditions were determined to increase the stringency of primer hybridization such as lower MgCl2 concentrations and higher annealing temperatures. Някои PCR бяха определени условия за увеличаване на строгостта на първия хибридизация като MgCl2 по-ниски концентрации annealing и по-високи температури.
Furthermore, the concentration of enzyme and primers, the annealing time, extension time, and number of PCR cycles all were found to effect the specificity of the PCR. Освен това, концентрацията на ензим и грундове, на annealing време, удължаване времето, както и броя на PCR цикли всички бяха намерени за действие спецификата на PCR.
Also, the concentration of a specific sequence in a sample can also influence the relative homogeneity of the PCR products (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates and magnesium in an appropriate buffer are also important ingredients for PCR. The efficiency and specificity of PCRs can be affected by variations in the concentration and ratio of free magnesium, deoxyribonucleotide triphosphates, and primers. Освен това, концентрацията на определена последователност в проба също може да повлияе на относителна хомогенност на PCR продукти (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide трифосфати и магнезий в подходящ буфер също са важни съставки за PCR. Ефективността и спецификата на PCRs може да бъде повлияна от промени в съотношението на концентрацията и свободно магнезий, deoxyribonucleotide трифосфати, и грундове. These reagents must be optimized in order to achieve high specificity and yield (14). It was also discovered that the effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction (15). Тези реактиви трябва да бъдат оптимизирани с цел постигане на високи добиви и специфичност (14). Също така беше открито, че влиянието на температурата и oligonucleotide първия дължина на спецификата и ефективността на усилвателя от полимеразноверижна реакция (15).
The inactivation of the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at the high temperature required for strand separation required the addition of enzyme after the denaturation step of each cycle (5,6). Prior to 1988, anyone conducting a PCR reaction procedure was obliged to sit patiently by a series of water baths or heating blocks and add a fresh aliquot of E.Coli DNA polymerase after each denaturation step, which was typically carried out by immersing the reaction vessel in boiling water for ½ a minute to 3 minutes (7). This rather tedious step was eliminated by the introduction of a thermostable DNA polymerase, the Taq DNA polymerase (12) once, at the beginning of the PCR reaction. The thermostable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus aquaticus (Taq) (Figure 4) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity, automation, and utility of the polymerase chain reaction (1,7,12). The Taq enzyme can withstand repeated heating to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for the extension is already present (1,7). However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development” (8), the purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus ( Taq ) (12). Инактивирането на Klenow фрагмент от Escherichia коли ДНК полимеразноверижна I на висока температура, необходима за отделяне нишка се изисква добавянето на ензим, след денатурация стъпка на всеки цикъл (5,6). Преди 1988 г., всеки, който провежда PCR реакция на процедурата е длъжен търпеливо да седят със серия от водни бани, отопление или блокове и да добавите нов аликвот на E. coli, ДНК, полимеразноверижна денатурация след всяка стъпка, която бе извършена от обикновено immersing реакцията кораб в вряща вода за минута ½ до 3 минути (7 ). Скоро tedious Тази стъпка бе отстранен чрез въвеждането на ДНК thermostable полимеразноверижна на Taq ДНК полимеразноверижна (12), след като в началото на PCR реакция. Thermostable на свойства на ДНК, полимеразноверижна дейност са били изолирани от Thermus aquaticus (Taq) (Фигура 4), които растат в geysers на над 110, и са допринесли значително за добив, специфичност, автоматизация, както и за комунални услуги на полимеразноверижна реакция (1,7,12). Taq на ензим може да повтори withstand отопление на 94 в, така и всеки път, сместа се охлажда да позволи на oligonucleotide грундове името на катализатор за разширяване вече е до момента (1,7). Все пак, annealing високи температури не са установени до едно-единствено "най-важното за развитие на PCR за развитие" (8), на пречистване и търговско разпространение на топло-устойчиви на ДНК полимеразноверижна от thermophilic бактерия Thermus aquaticus (Taq) (12).
The isolation of a heat-resistant DNA polymerase also allowed primer annealing and extension to be carried out at elevated temperatures (1,7,12,13), thereby reducing mismatched annealing to nontarget sequences (non-specific amplification) or increasing specificity. In this way, for many amplifications the PCR product could be detected as a single ethidium bromide-stained band on an electrophoretic gel (12). This increased specificity also increased DNA yield of the target sequence. Moreover, longer PCR products could be amplified from genomic DNA, probably due to a reduction in the secondary structure of the template strands at the elevated temperature used for primer extension. The upper size limit for Klenow fragment polymerase amplification was only about 400bp. Taq polymerase and other thermostable polymerases have synthesized fragments up to 10 kb (1,7,12,13). The availability of Taq polymerase has also greatly simplified the automation of the reaction as it is a much easier task to construct an apparatus that will cycle a reaction tube through different temperatures than to manufacture a device that would perform both the thermocycling and the addition of enzyme aliquots. Currently there is a great variety of thermocyclers available commercially. This development has been a significant factor in the rapid application of this technology by the scientific community (7). На изолацията на топло-устойчиви на ДНК полимеразноверижна да разреши първо annealing и удължаване срока да се извършва при повишени температури (1,7,12,13), като по този начин намаляване на несъответстващи annealing да nontarget последователности (не-специфични усилвателя) или увеличаване на специфичност. В Така, в продължение на много amplifications на PCR продукт може да бъде открита, както едно ethidium бромид-оцветени лента на electrophoretic гел (12). Това увеличава специфичността също са се увеличили с ДНК добив на целеви последователност. Нещо повече, вече PCR продукти могат да бъдат допълнени от genomic ДНК, най-вероятно се дължи на намаление на средното структурата на шаблона направления в повишена температура, използвана за първи удължаване на срока. Горната граница за размера Klenow фрагмент полимеразноверижна усилвателя е бил само около 400bp. Taq полимеразноверижна и други thermostable полимерази са синтезирани фрагменти до 10 kb (1,7,12,13). Наличието на Taq полимеразноверижна също е значително опростен в автоматизация на реакция, тъй като това е много по-лесно задачата да построим апарат, който ще цикъл реакция тръбата, чрез различни температури, отколкото за производството на устройството , които ще се представят както thermocycling и добавянето на ензима аликвоти. момента има голямо разнообразие от thermocyclers налични в търговската мрежа. Това развитие е значителен фактор за бързото прилагане на тази технология от научната общност (7).
In addition to the production of double-stranded, blunt-ended DNA fragments which may be formed by PCR, two other features of the PCR scheme contribute greatly to the utility of PCR. First, the position of binding of the primers defines the boundaries of the amplified fragment and therefore the prior molecular cloning requirement of restriction endonuclease recognition sites is not required for PCR. As only a limited number of DNA sequences are restriction sites, PCR greatly increases the flexibility of choice of fragment size and composition. Secondly, it is not necessary for PCR oligonucleotides to be exactly complementary to the template DNA. “Tails” may be added to the 5’ end of the primer to introduce sequences within the priming sites which thus may be exploited to introduce restriction endonuclease recognition sites or other useful sequences such as mutations into the amplified DNA. This phenomena allowed the emergence of PCR as a method for rapid DNA cloning (1,7,13). В допълнение към производството на двойно усукана, притъпяване-приключила ДНК фрагменти, които могат да бъдат формирани чрез PCR, две други характеристики на PCR схема допринесе значително за комунални услуги на PCR. Първо, позицията на задължителен на грундове определя границите на Фрагмент на задълбочени и по тази причина преди молекулно клониране изискването за ограничаване endonuclease признаване сайтовете не се изисква за PCR. Тъй като само ограничен брой на ДНК секвенции, са ограничение сайтове, PCR значително увеличаване на гъвкавостта на избора на фрагмент големина и състав. второ място, това е не е необходимо за PCR oligonucleotides да бъде точно като допълнение към шаблон на ДНК. "тура", могат да бъдат добавени към 5 'края на първия за въвеждане на редиците в priming сайтове, които по този начин може да бъде използвана за въвеждане на ограничението endonuclease признаване сайтове или други полезни последователности като мутации в ДНК, задълбочени. Този феномен позволява появата на PCR като метод за бързо клониране на ДНК (1,7,13).
Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning was first conducted using a 110 bp DNA fragment amplified by PCR and oligonucleotide primers which contained restriction endonuclease recognition sites added to their 5’ ends. These sites were used to facilitate cloning of the amplified DNA into an M13 plasmid (17). The 110 bp fragment was also sequenced to confirm that this approach was a rapid yet reliable approach to cloning. (Figure 5) Молекулярна клониране се е възползвала от появата на PCR като техника. Директен клониране за първи път е проведено с 110 bp ДНК фрагмент засилва от PCR и oligonucleotide грундове, които се съдържат ограничения endonuclease признаване сайтове добавят към своите 5 'приключва. Тези сайтове са били използвани за улесняване на клонирането на разширяване на ДНК в една M13 плазмида (17). За 110 bp фрагмент също беше sequenced да потвърдя, че този подход е бърза още надежден подход за клониране. (Фигура 5)
Cell-based DNA cloning involves DNA replication in vivo, which is associated with a very high fidelity of copying because of proofreading mechanisms. However, when DNA is replicated in vitro as with PCR, the copying error rate is considerably greater. The most widely used polymerase, Taq DNA polymerase however, has no associated 3’to 5’ exonuclease to confer a proofreading function. Thus the error rate due to base misincorporation during DNA replication is rather high for Taq : for a 1 kb sequence that has undergone 20 effective cycles of duplication, approximately 40% of the new DNA strands synthesized by PCR using this enzyme will contain an incorrect nucleotide resulting from a copying error (16). Cell-базирани ДНК клониране включва ДНК репликация в живея, която е свързана с много висока вярност на копиране, защото на редакция механизми. Въпреки това, когато ДНК е повторен ин витро с PCR, копиране на грешка процент е значително по-голяма. Преобладаващ полимеразноверижна, полимеразноверижна Taq ДНК, обаче, не е свързан 3'to 5 'exonuclease да предоставят редакция функция. Така процент грешка, поради базова misincorporation по време на ДНК репликация е доста висока за Taq: за 1 кБ последователност, че е бил подложен на 20 ефективен цикъл на дублирането, приблизително 40% от новите направления ДНК, синтезиран от PCR използването на този ензим, ще съдържа неправилна нуклеотидни в резултат на грешка при копирането (16). Therefore, even if the PCR reaction involves amplification of a single DNA sequence, the final product will be a mixture of almost matching, but not identical DNA sequences. Despite the errors due to replication in vitro , DNA sequencing of the total PCR product may give the correct sequence due to the fact that the incorporation of incorrect bases is essentially random and the contribution of one incorrect base on one or more strands is overwhelmed by the contributions from the huge majority of strands which will have the correct sequence. However, if the PCR product is to be cloned in cells, several individual clones may need to be sequenced in order to determine the correct (consensus) sequence, prior to conducting further experiments. Затова, дори ако PCR реакция включва усилвателя на една ДНК последователност, крайният продукт ще бъде смесица от почти съвпадение, но не е идентична ДНК последователности. Въпреки грешките, дължащи се репликация ин витро, ДНК секвениране на общото PCR продукт може да даде правилната последователност дължи на факта, че включването на неправилен бази е по същество произволно и приноса на една неправилна основа на един или повече направления е претоварени от вноски от огромно мнозинство от направления, които ще имат правилна последователност. Въпреки това, ако PCR продуктът е да бъдат клонирани клетки в няколко отделни клонове може да се наложи да се sequenced, за да определи правилния (консенсус) последователността, преди провеждане на допълнителни експерименти.
More recently, the problem of infidelity of DNA replication during the PCR reaction has been considerably reduced by using alternative heat-stable DNA polymerases which have associated 3’ to 5’ exonuclease activity. Pyrococcus furiosus ( Pfu ) DNA polymerases and Thermococcus Litoralis (VENT) are becoming more widely used because of the proofreading conferred by their associated 3’ to 5’ exonuclease activity (18). The resulting PCR product of Pfu for example, has a much lower level of mutations introduced by copying errors: for a 1 kb segment of DNA that has undergone 20 effective cycles of duplication, about 3.5% of the DNA strands in the product carry an altered base (16). В последно време, проблемът с неверието на ДНК репликация по време на PCR реакция е значително намалено с използването на алтернативни топло-стабилна ДНК полимеразите, които са свързани 3 "до 5" exonuclease дейност. Pyrococcus furiosus (Pfu) и ДНК полимеразите Thermococcus Litoralis (вентилация) се среща все по-широко използван, защото на редакция, предоставени им от 3 до 5 'exonuclease дейност (18). Получените PCR продукт на Pfu например, е много по-ниско ниво на мутации, въведена с копиране на грешки: за 1 кБ сегмент на ДНК, които са преминали 20 ефективен цикъл на дублирането, около 3,5% от ДНК направления в продукта се променя една база (16).
New approaches to improve specificity have been developed based on the recognition that the Taq DNA polymerase retains considerable enzymatic activity at temperatures well below the optimum for DNA synthesis. Thus, primers annealing non-specifically to a partially single stranded template region can be extended before the reaction reaches 72°C for extension of specifically annealed primers. If the DNA polymerase is activated only after the reaction has reached high (>70°C) temperatures, non-target amplification can be minimized (19,20). This “Hot start” approach can be accomplished by manual addition of an essential reagent to the selection tube at elevated temperatures. The addition of ssDNA binding protein has also been reported to increase specific amplification. A more user friendly approach is to use either inhibition or inactivation of the DNA polymerase itself. Нови подходи за подобряване на спецификата са разработени на базата на признаването, че Taq ДНК полимеразноверижна си остава до голяма степен ензимна активност при температури доста под оптималното за ДНК синтеза. Така, грундове annealing не-конкретно с едно-единствено частично изолирани шаблон регион може да бъде удължен преди реакция достига 72 ° С в продължение на разширяването на конкретно отгрят грундове. Ако ДНК полимеразноверижна се активира едва след реакцията е достигнал висока (> 70 ° С) температури, нецелеви усилвателя може да бъде сведено до минимум (19,20). Това "горещи проекта "Подход може да бъде осъществена чрез ръчно добавяне на основен реагент за избор на тръбата до повишени температури. Добавянето на ssDNA свързващ белтък също се докладва за увеличаване на специфични усилвателя. Един потребител приятелски подход е да се използва или подтискане или обезвреждането на ДНК полимеразноверижна само себе си. Two types of inhibition of Taq DNA polymerase have been tried including oligonucleotide inhibition (21) and antibody (22) inhibition. Два типа подтискане на Taq ДНК полимеразноверижна са опитвали, включително oligonucleotide инхибиране (21) и антитела (22) инхибиране. Highly specific oligonucleotide inhibitors of both Taq DNA polymerases have been produced. Много специфични oligonucleotide инхибитори на двете Taq ДНК полимеразите са били произведени. These selectively inhibit DNA polymerase activity at temperatures below 40°C and have been shown to function in Hot Start applications. Тези селективно инхибира ДНК полимеразноверижна дейност, при температура под 40 ° С и за които е доказано, да функционира по-горещо Старт приложения. Alternatively, one can use an antibody against Taq DNA polymerase. В противен случай може да се използва антитела срещу Taq ДНК полимеразноверижна. The antibody inhibits the DNA polymerase until the temperature of the PCR is such that the antibody is denatured at a temperature greater than 55°C, thereby releasing the enzyme. В антитела инхибира ДНК полимеразноверижна, докато температурата на PCR е такава, че антителата се денатурират при температура над 55 ° C, като по този начин освобождаването на ензима. However there are disadvantages to this type of Hot Start conditions. Въпреки това съществуват недостатъци на този тип Горещи Старт условия. In this case, one needs an antibody for each different enzyme used in a PCR and for a large number of PCRs this can rise costs significantly. В този случай, се нуждае от едно антитяло за всеки различни ензими, използвани в PCR и за голям брой PCRs това може да породи разходи значително. The most convenient form of Hot Start is to modify the DNA polymerase in such a way that it is inactive at room temperature (temperature-sensitive mutant), and is only re-activated following incubation at 95°C for 6-15 minutes (23). Най-удобна форма на топла Започнете да е промяна на ДНК, полимеразноверижна по такъв начин, че тя не е активна при стайна температура (температура-чувствителни мутант), и е само на ре-активирана след инкубация при 95 ° С в продължение на 6-15 минути (23 ).
Because of its simplicity, PCR is a popular technique with a wide range of applications Поради своята простота, PCR е популярна техника с широк спектър от приложения
including direct sequencing, genomic cloning, DNA typing, detection of infectious microorganisms, site-directed mutagenesis, prenatal genetic disease research, and analysis of allelic sequence variations (1,7,13,16) which depend on essentially three major advantages of the method: включително директни секвениране, genomic клониране, пишете на ДНК, за откриване на инфекциозни микроорганизми, сайтове, насочени мутагенеза, prenatal генетични изследвания на болестта, както и анализ на allelic последователност вариации (1,7,13,16), които основно зависят от три основни предимства на метода :
Speed and ease of use: DNA cloning by PCR can be performed in a relatively short amount of time, within a few hours. Usually, a PCR reaction consists of around 30 cycles each cycle containing a denaturation, synthesis and reannealing step, with an individual cycle typically taking 3 Бързина и лекота на използване: ДНК клониране чрез PCR може да се извършва в относително кратък период от време, в рамките на няколко часа. Обикновено един PCR реакция се състои от около 30 цикъла на всеки цикъл, съдържащ денатурация, синтеза и reannealing стъпка, с индивидуална цикъл, като обикновено 3 
5 min in an automated thermal cycler. This is clearly quicker than the time required for cell-based DNA cloning, which could take weeks of time. Furthermore, it is quite easy to setup a PCR reaction and the use of a thermocycler machine is also easy. Some time is required for the design and synthesis of oligonucleotide primers, but this has been simplified by the availability of computer software for primer design and rapid commercial or academic synthesis of custom oligonucleotides. Optimization of PCR conditions may be required such as primer annealing temperature, magnesium concentration, and primer concentration. However, the creation of gradient PCR machines which allow a variety of primer annealing temperatures to be tested at the same time has greatly decreased the time required for this step. 5 мин по автоматизиран термични cycler. Това е ясно-бързо от времето, необходимо за клетъчната ДНК-базирана клониране, които биха могли да вземат седмици от време. Нещо повече, тя е доста лесен за настройка на един PCR реакция и използването на машината е също thermocycler лесно. известно време е необходимо за проектирането и синтеза на oligonucleotide грундове, но това е опростено от наличието на компютърен софтуер за първия дизайн и бърза или академичен синтез на собствени oligonucleotides. Оптимизация на PCR условия могат да бъдат изисквани като първи annealing температура, концентрация, магнезий, както и първия концентрация. Все пак, създаването на наклон PCR машини, които позволяват различни първия annealing температури да бъдат тествани в същото време е значително намалява времето, необходимо за тази стъпка. Once the optimal conditions for a reaction have been obtained, the reaction can then be simply repeated (1,7,13,16). След приключване на оптимални условия за реакция, са били получени, реакцията може да бъде просто повтарят (1,7,13,16).
Sensitivity: PCR is capable of amplifying sequences from minute amounts of target DNA, even the DNA from a single cell (24). Such exquisite sensitivity has afforded new methods of studying molecular pathogenesis and has found numerous applications in forensic science, in diagnosis, in genetic linkage analysis using single-sperm typing and in molecular paleontology studies, where samples may contain minute numbers of cells. Чувствителност: PCR е в състояние да Усилване последователности от минута размера на целевата ДНК, дори и на ДНК от една клетка (24). Такива изискана чувствителност е предоставена на нови методи за изследване на молекулярната патогенезата и е открила множество приложения в съдебно науката, в диагностиката, в генетична връзка анализ на използването на едно-сперма, пишете и по молекулярна палеонтология проучвания, където е на проби минути може да съдържа номера на клетките. However, the extreme sensitivity of the method means that great care has to be taken to avoid contamination of the sample under investigation by external DNA, such as from minute amounts of cells from the operator (1,7,13,16). Въпреки това, изключителна чувствителност на метода е, че много внимателно трябва да бъдат взети за избягване на заразяване на извадката, обект на разследване от външни ДНК, като от минута суми на клетки от оператора (1,7,13,16).
Robustness: A broad range of nucleic acid sources are suitable templates for PCR amplification. Purified DNAs from various species and sources have been amplified. PCR can permit amplification of specific sequences from material in which the DNA is badly degraded or embedded in a medium from which conventional DNA isolation is problematic. Robustness: широка гама от Нуклеинова киселина са подходящи източници на шаблони за PCR амплификация. Пречистена DNAs от различни видове и източници са задълбочени. PCR може да разреши усилвателя на специфични материали, последователности от ДНК, в която е силно влошено, или вградена в един носител, от които конвенционалните за изолиране на ДНК, е проблематично. As a result, it is again very suitable for molecular anthropology and paleontology studies, for example the analysis of DNA recovered from archaeological remains. В резултат на това, че е отново много подходящи за молекулярна антропология и палеонтология проучвания, например, анализът на ДНК, възстановени от археологическите останки. It has also been used successfully to amplify DNA from formalin-fixed or paraffin-embedded tissue samples, which has important applications in molecular pathology and, in some cases, genetic linkage studies. Той също така е била използвана успешно да се разширят ДНК от формалин-фиксирана или парафин-тъканни проби, вграден, което е важно по молекулярна патология молби, а в някои случаи, връзката генетични изследвания. Generally, the success of PCR amplification is greatest when target fragments are relatively abundant (1,7,13,16). Като цяло, успехът на PCR амплификация е най-голямо, когато целта фрагменти са сравнително богат (1,7,13,16).
Despite its huge popularity, PCR has certain limitations as a method for selectively cloning specific DNA sequences. Въпреки голямата си популярност, PCR има някои ограничения, като метод за селективно клониране на специфични ДНК последователности.
In order to construct specific oligonucleotide primers that permit selective amplification of a particular DNA sequence, some prior sequence information is usually necessary. С цел да се изгради специфичен oligonucleotide грундове, че разрешението за подбор усилвателя на конкретна последователност на ДНК, някои преди последователност информация обикновено е необходимо. This normally means that the DNA region of interest has been partly characterized previously, often following prior cell-based DNA cloning. Това обикновено означава, че ДНК региона на интерес е отчасти характеризира преди това, често пъти след предварително клетъчната ДНК-базирана клониране. However, a variety of approaches have been developed that reduce or even exclude the need for prior DNA sequence information concerning the target DNA. Previously uncharacterized DNA sequences can sometimes be cloned using PCR with degenerate oligonucleotides if they are members of a gene or repetitive DNA family at least one of whose members has previously been characterized. Въпреки това, най-различни подходи, са разработени, които намаляват или дори да се изключи необходимостта от предварително ДНК последователност информация относно целта на ДНК. Рано uncharacterized ДНК последователности понякога може да бъдат клонирани чрез PCR с degenerate oligonucleotides, ако те са членове на ген или повтарящи ДНК семейство най-малко един от членовете на който е бил характеризира. In some cases, PCR can be used effectively without any prior sequence information concerning the target DNA to permit indiscriminateamplification of DNA sequences from a source of DNA that is present in extemely limited quantities. В някои случаи, PCR може да се използва ефективно без предварителна информация, отнасяща се до последователността на ДНК цел да се позволи indiscriminateamplification на ДНК последователности от един източник на ДНК, която е в момента extemely ограничени количества. Therefore, although PCR can be applied to ensure whole genome amplification, it does not have the advantage of cell-based DNA cloning in offering a way of separating the individual DNA clones comprising a genomic DNA library. Затова, макар и PCR може да се приложи за да се гарантира целия геном усилвателя, тя не е в полза на клетъчната ДНК-базирана клониране при предлагането начин за разделяне на отделните клонове на ДНК се състои от genomic ДНК библиотека.
The amount of PCR product obtained in a single reaction is also much more limited than the amount that can be obtained using cell-based cloning where scale-up of the volumes of cell cultures is possible. Размерът на PCR продукт, получен в един реакция също е много по-малък от размера, които могат да бъдат получени при използване на клетъчни базирани клониране-нагоре, където скалата на обемите на клетъчни култури е възможно. The efficiency of a PCR reaction will vary from template to template and according to various factors that are required to optimize the reaction but typically only comparatively small amounts of product are achieved. Ефективността на PCR реакция ще варират от шаблон за шаблон и според различни фактори, които са необходими за оптимизиране на реакцията, но обикновено само сравнително малки суми на продукта, са постигнати.
Although the theoretical yield of PCR is exponential, the actual yield of a PCR is much less indicating that the scheme is operating with less than its maximum potential. For example, the amount of product at each cycle eventually levels off. This plateau may be explained by the following phenomena. First, some of the template may never be available due to strand breaks or failure of the DNA to dissociated from other macromolecules during purification and the initial thermocycles. Secondly, the amount of enzyme is finite and eventually activity may decrease. Thirdly, as the concentration of the double-stranded product reaches high levels, competition increases between annealing of template (PCR product) to primer and reannealing of the complementary template strands (1,7,13). Макар че теоретично добив на PCR е изразител, реалната доходност от PCR е много по-малко се посочва, че схемата работи с по-малко от максималния си потенциал. Така например, размерът на продукта при всеки цикъл в крайна сметка нивата на разстояние. Плато Това може да бъде обяснено със следното явления. Първо, някои от шаблон може никога да не бъдат на разположение, поради нишка прекъсвания или провала на ДНК да се разглежда отделно от други макромолекули по време на пречистване и първоначалната thermocycles. Второ, размерът на ензим е с ограничено поемане на дейност и в крайна сметка могат да се понижат. На трето място, тъй като концентрацията на двойно усукана продукт да достигне високо ниво, увеличаване на конкуренцията между annealing на шаблон (PCR продукт) за първи и reannealing на допълнителни шаблона направления (1,7,13).
An obvious and many times great disadvantage of PCR as a DNA cloning method has been the size range of the DNA sequences that can be cloned. Очевидна и много пъти по голям недостатък на PCR като ДНК клониране метод е бил с размер на ДНК последователности, които могат да бъдат клонирани. Unlike cell-based DNA cloning where the size of cloned DNA sequences can approach 2 Mb, reported DNA sequences cloned by PCR have typically been in the 0.1 За разлика от клетъчната ДНК-базирана клониране, когато размерът на клонирани ДНК последователности може подход, 2 MB, докладвани на ДНК секвенции клонирани чрез PCR обикновено са били в 0,1 
5 kb size range, often at the lower end of this scale. 5 kb с размер, често пъти по-ниски края на тази скала. Small fragments of DNA can usually be amplified easily by PCR, however it becomes increasingly more difficult to obtain efficient amplification as the desired product length increases. Малки фрагменти от ДНК може да бъде разширена лесно чрез PCR, обаче тя става все по-трудно да се получи ефективна усилвателя на желания продукт, като дължината се увеличава. Barnes (25) recognized a target length limitation to PCR amplification of DNA. He used a combination of a high level of an exonuclease-free, N-terminal deletion mutant of Taq DNA polymerase, Klentaq1, with a very low level of a thermostable DNA polymerase exhibiting a 3'-exonuclease activity (Pfu, Vent, or Deep Vent) to conduct high fidelity long PCR. Барнс (25), признати за цел ограничаване на продължителността на PCR амплификация на ДНК. Той използва комбинация от високо ниво на exonuclease свободни, N-терминал заличаване мутант на Taq ДНК полимеразноверижна, Klentaq1, с много ниско ниво на ДНК thermostable полимеразноверижна излагането един 3'-exonuclease дейност (Pfu, вентилация, или дълбоко вентилация) за провеждане висока вярност дълго PCR. At least 35 kb of bacteriophage lambda can be amplified to high yields from 1 ng of lambda DNA template. Use of this method yielded increased base-pair fidelity, the ability to use PCR products as primers, and the maximum yield of target fragment. Other conditions have been identified for effective amplification of longer targets, including amplification of up to 22 kb of the beta-globin gene cluster from human genomic DNA and up to 42 kb from phaga lambda DNA (26). Най-малко 35 kb на bacteriophage ламбда може да бъде разширена до високи добиви от 1 на ДНК на ламбда шаблон. Прилагането на този метод, получени в резултат увеличена база-двойка вярност, способността да се използва PCR продукти, грундове, а максималният добив на целеви фрагмент. Други условия са идентифицирани за ефективно усилвателя на вече цели, включително и усилвателя до 22 kb на бета-globin ген купа от човешка genomic ДНК и до 42 kb от phaga ламбда ДНК (26). The conditions for these long PCRs included increased pH, addition of glycerol and dimethyl sulfoxide, decreased denaturation times, increased extension times, and the use of a secondary thermostable DNA polymerase that possesses a 3'-to 5'-exonuclease, or "proofreading," activity. Условията за тези дълги PCRs включени увеличава рН, добавянето на глицерол и диметил sulfoxide, е намалял денатурация пъти, увеличава разширяване пъти, както и използването на вторичен thermostable ДНК полимеразноверижна, че притежава 3'-до 5'-exonuclease, или "редакция, "Дейност. The "long PCR" protocol maintained the specificity required for targets in genomic DNA by using lower levels of polymerase and temperature and salt conditions for specific primer annealing. The ability to amplify DNA sequences of 10-40 kb will bring the speed and simplicity of PCR to genomic mapping and sequencing and facilitate studies in molecular genetics (26). Generally, the conditions for long range PCR involve a combination of modifications to standard conditions with a two-polymerase system. В "PCR дълъг" протокол поддържа спецификата изисква за цели в genomic ДНК, чрез използване на по-ниски нива на полимеразноверижна и температура и сол за специфични условия на първия annealing. Възможността да се разширят ДНК последователности от 10-40 kb ще донесе на скоростта и простота на PCR genomic за картографиране и секвениране и за улесняване на проучванията в молекулярната генетика (26). цяло, условията за дълго PCR гама включва комбинация от промени в стандартни условия с две полимеразноверижна система. This provides optimal levels of DNA polymerase and 3’to 5’ exonuclease activity which serves as a proofreading mechanism (16). Това осигурява оптимално ниво на ДНК, полимеразноверижна и 3'to 5 'exonuclease дейност, която служи като механизъм за редакция (16).
Thermocyclers which automatically regulate temperatures for PCR cycling were introduced in 1986 (Figure 6). In addition to the advances in PCR reagents, new instruments for automated thermal cycling and for analyzing PCR products have been developed. New thermal cyclers have increased rates of heating, cooling, and heat transfer to modified reaction vessels. The reaction vessels accommodated by the first generation thermal cyclers (or even water baths and heating blocks) were standard plastic microfuge tubes. PCR amplification in thin capillary tubes allowed rapid thermal cycling, and DNA synthesis to 20s. The speed of the temperature changes achieved in these systems has allowed the precise definition of temperature optima for each individual step in the PCR cycle. The new generation thermal cyclers also accommodate more samples, have more precise thermal profiles, and are programmable (13). Thermocyclers което автоматично регулиране на температурата за PCR колоездене бяха въведени през 1986 г. (графика 6). В допълнение към напредъка в PCR реагенти, нови инструменти за автоматизирани системи за топлинна колоездене, както и за анализ на PCR продукти са разработени. Ню термични cyclers са се увеличили размера на отопление, охлаждане, както и прехвърляне на топлинна промяна реакция на плавателни съдове. Реакцията кораби, настанено от първо поколение термални cyclers (или дори вода и санитарни помещения, отоплението блокове) са стандартни microfuge пластмасови тръби. PCR амплификация в тънки периферна позволи бързото топлинни тръби, колоездене, както и за синтеза на ДНК 20s. Скоростта на промени в температурата, постигнати в тези системи е позволило точното определение на температурата ОПТИМА за всяка отделна стъпка в цикъл на PCR. Новото поколение термални cyclers също настаняване повече проби, са по-точни термични профили, и са програмируеми (13 ).
One of the least appreciated contributions to the widespread application of PCR has been the development of reliable automated chemistry for oligonucleotide synthesis. Until recently, the construction of a single oligonucleotide was a substantial task that could only be performed by a skilled organic chemist. Now it is possible to purchase either an oligonucleotide synthesizer that can be operated by a technician or the oligonucleotides themselves from a commercial or academic source. Multiplex oligonucleotide synthesis machines have been constructed with the aim of reducing the overall cost of synthesis (27,28). Един от най-слабо оценени принос за широкото прилагане на PCR е развитието на надеждна автоматизирани химия за oligonucleotide синтез. Доскоро изграждането на единна oligonucleotide е съществена задача, която може да се извършва само от квалифицирани органични химик. Сега той е възможно да закупят един или oligonucleotide Синтезирам, които могат да бъдат експлоатирани от един техник или oligonucleotides възползват от търговско или академична източник. Мултиплекс oligonucleotide синтеза машини са били построени с цел намаляване на общите разходи на синтеза (27,28). As the oligonucleotides define the eventual PCR products, there is little doubt that in the absence of their ready supply, PCR would not have enjoyed the wide acceptance that it has gained today (13). Тъй като oligonucleotides определи евентуалното PCR продукти, няма съмнение, че при липсата на тяхната готовност за доставка, PCR не би радва на широка приемане, че е придобит днес (13).
Researchers agreed early on that the design of PCR primers was difficult and unreliable. Computer programs were devised to take all of the design criteria into account. Изследователи договорени по-отрано, че дизайнът на PCR грундове беше трудно и ненадеждни. Компютърни програми са били разработени да предприемат всички на дизайна критерии под внимание. One of the first programs written for primer design was Olga which made use of the implementation of Digital Research GEM (Graphics Environment Manager) on the Atari ST (29). Една от първите програми, написани за първия дизайн на Олга, която е използвала за изпълнението на изследователски Digital GEM (Graphics мениджър на околната среда) на Atari ST (29). Olga was specifically suited to the polymerase chain reaction (PCR) allowing simultaneous analysis of two primer sequences. Олга беше специално пригоден за полимеразноверижна реакция (PCR) позволява едновременен анализ на две първи последователности. The advantage of Olga was that it provided in one program analyses for direct repeats, secondary structures and primer dimerization as well as several useful 'finishing' tools for workers engaged in PCR optimization and oligonucleotide syntheses. The Primer3 program at the Whitehead Institute is now thought to be the most reliable and versatile tool currently available (30). Основното предимство на Олга беше, че тя е предвидено в една програма анализи за директна повтаря, вторични структури и първия dimerization както и няколко полезни "довършителни" Инструменти за работници, които участват в PCR оптимизация и oligonucleotide syntheses. Primer3 В програмата на Уайтхед институт сега е мисълта за най-надеждни и гъвкави инструмент за наличните в момента (30).
PCRs can now be performed enabling the amplification of DNA fragments up to several kilobases in length by more than one million times their initial abundance. The procedure is highly automatable and requires just a few hours from beginning the thermocyling to product analysis. This was not the case previously, and the practical requirements for performing a PCR have been greatly simplified since the first manuscripts of the method (13). Today, most of the initial hitches or inefficiencies of the PCR have been worked out (8). Furthermore, PCR has expanded to include more than 270,000 articles (31). PCRs сега могат да бъдат изпълнявани позволява на усилвателя на ДНК фрагменти до няколко kilobases с дължина от повече от един милион пъти по първоначалното им изобилие. Процедурата е много automatable и изисква само няколко часа от началото на thermocyling за анализ на продукта. Това не беше случай преди това, както и практическите изисквания за изпълнение на PCR са значително опростени, тъй като първите ръкописи на метода (13). Днес, по-голямата част от първоначалния hitches или неефективността на PCR са изработили (8). Нещо повече, PCR е разширена да включва повече от 270000 предмети (31).
Polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification however it requires thermal denaturation or thermocycling to separate the two DNA strands. In vivo , DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins. DNA helicase, a DNA polymerase accessory proteins acts to separate duplex DNA inside cells. Vincent et al. (32) have devised a new in vitro isothermal DNA amplification method by mimicking the in vivo replication mechanism. Helicase-dependent amplification (HDA) utilizes a DNA helicase to generate single-stranded templates for primer hybridization. Subsequent primer extension is then catalyzed by a DNA polymerase. HDA does not require an expensive thermocycler and thus PCR may be performed practically anywhere. In addition, it offers several advantages over other isothermal DNA amplification methods by having a simple reaction scheme and being a true isothermal reaction that can be performed at one temperature for the entire process. HDA offers great promise in the development of simple portable DNA diagnostic devices to be used in the field and at the point-of-care (32).
It is said the simplest and most convenient way to define PCR is as a technique . However, such a categorization eliminates the history of PCR's development as many individuals over the years contributed to the ideas behind the theory of PCR and the fine-tuning of the technique. The next simplest answer is to name an individual as the inventor of the polymerase chain reaction. Karry Mullis was awarded the Nobel Prize for Chemistry in 1993 for his discovery of PCR. However, this discovery is contested amongst many scientists, all of which may have contributed to unlocking this puzzle.
It has also been said that PCR did not exist until it was made to work in an experimental system. With this in mind, merely the thought of a concept is not sufficient; a concept must have been successfully been put into practice (33).
Although there is doubt as to the ultimate creator of PCR, and doubt as to the possibility that PCR may somehow or sometime be replaced, there is little doubt the impact that PCR has created over a short time span on the study of molecular biology and life.
References
1. Arnheim, N; Erlich, H; Polymerase Chain Reaction Strategy. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, VOL. 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2. Appenzeller T. Democratizing the DNA sequence., Science , 1990 Mar 2, 247(4946).
3. Saiki R, K.; Scharf S; Faloona F; Mullis K. B; Horn G. T; Erlich HA; Arnheim N., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science , 1985 Dec 20, 230(4732):1350-4.
4. Southern, EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-518.
5. Mullis K. B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R. K; Horn G; Erlich HA, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , 1986
6. Mullis K. B; Faloona FA Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology , 1987, 155:335-50.
7. Gibbs, RA; DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry, 1990, 62:1202-1214.
8. Mullis, KB; The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction, Scientific American, April 1990.
9. Kleppe, KE; Khorana , HG; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346.
10. Keir, H; DNA polymerases from mammalian cells. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1965;4:81-128.
11. Fansler, BS; Eukaryotic DNA polymerases: their association with the nucleus and relationship to DNA replication. Int Rev Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12. Saiki R. K; Gelfand D. H; Stoffel S; Scharf S. J; Higuchi R; Horn G. T; Mullis K. B; Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science , 1988 Jan 29, 239(4839):487-91.
13. Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, JJ Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction., Science , 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14. Williams, JF; Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques. 1989 Jul-Aug;7(7):762-9.
15. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB. The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction. DNA Cell Biol. 1991 Apr;10(3):233-8.
16. Strachan, T; Read AP; Human Molecular Genetics 2 . 1999. John Wiley & Sons Inc. Chapter 6 Section 1.
17. Scharf S. J; Horn G. T; Erlich HA Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science , 1986 Sep 5, 233(4768):1076-8.
18. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15;24(18):3546-51.
19. Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K. 1990 6th Int.Conf . AIDS . Abstr.
20. D’Aquila, RT, Bechtel, LJ, Videler, JA, Eron, JJ, Goeczyca, P., Kaplan, JC 1991. Nucleic Acids Res. 19:3749.
21. Dang C, Jayasena SD. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol. 1996 Nov 29;264(2):268-78.
22. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23. Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):6139-47.
24. H. Li, UB Gyllenstein, X. Cui, RK Saiki, H. Ehrlich, and N. Arnheim. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells Nature 335: 414-417.
25. Barnes WM.; PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Mar 15;91(6):2216-20.
26. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Jun 7;91(12):5695-9.
27. Caruthers MH, Barone AD, Beaucage SL, Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Tang JY. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods Enzymol. 1987;154:287-313.
28. Beattie KL, Logsdon NJ, Anderson RS, Espinosa-Lara JM, Maldonado-Rodriguez R, Frost JD 3rd. Gene synthesis technology: recent developments and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Dec;10(6):510-21.
29. Bridges CG. Olga--oligonucleotide primer design program for the Atari ST. Comput Appl Biosci. 1990 Apr;6(2):124-5.
30. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 2000;132:365-86.
31. Location world wide web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed Search: “PCR”
32. Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Jul 09.
33. Paul Rabinow. Making PCR, A Story of Biotechnology , University of Chicago Press, 1996
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved.
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
