Welcome to Molecular Station! Добре дошли в молекулярна станция!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Трябва да се регистрирате преди да можете да публикувате на нашите форуми, или да използвате допълнителни функции. Register Now! Регистрирайте се! Its Free and Fast! Тяхното свободно и бързо!

Already registered? Вече сте регистрирани? Login now below. Вход за сега по-долу.

User Name: Име:

Password: Парола:

Remember Me? Запомни ме?

Already registered and Forgot your password? Вече сте регистрирани и Забравили сте паролата си? Click below to recover it. Кликнете по-долу, за да го възстанови.

Recover Lost Password Забравена Забравена парола

Join now - it's fast and free! Присъединете се към момента - това е бързо и безплатно!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Молекулярна станция е най-голямата мрежа от изследователи, учени и любители на науката навсякъде!

Recent Forum Posts Нова Форум постове

Mass Spectrometry Масова спектрометрия

What is a Mass Spectrometer? Какво е масов Спектрометър?

A mass spectrometer is based on the simple fact that different chemicals have different masses, and this is what determines what chemicals are present in a sample. Масов спектрометър се основава на простия факт, че различни химикали имат различни маси, и това е, което определя какви химикали се намират в една проба. There are many types of mass spectrometers that not only analyze the ions differently but produce different types of ions; however they all use electric and magnetic fields to change the path of ions in some way. Има много видове масови спектрометри, че не само анализира йони, но по различен начин произвеждат различни видове йони, но всички те използват електрически и магнитни полета за промяна на пътя на йони по някакъв начин.

During the late 1980s and early 1990s, two new methods of sample ionization caused mass spectrometry to undergo a revolution in biopolymer analysis, namely ESI 38 and MALDI.39 Just over a decade ago, for the first time, mass spectrometric techniques that could measure the molecular masses of femtomole quantities of proteins in excess of 100 kDa, often to better than 0.01% accuracy, became widely available to protein chemists. През късната 1980 г. и началото на 1990 те години, двете нови методи на пробата йонизация, причинени масова спектрометрия да преминават революция в biopolymer анализ, а именно ESI 38 и MALDI.39 малко повече от едно десетилетие, за първи път, маса спектрометричен техники, които биха могли да се измери молекулни маси на femtomole количества протеини в повече от 100 kDa, често пъти с по-добро от 0,01% точност, станаха широко достъпни за протеин, химици. These methods are both successful in forming ions from large, labile biomolecules without significant degradation of the analyte. Тези методи са успешни в йони, които са от големите, нестабилно biomolecules без значително влошаване на аналитичен. Not only are they both sensitive techniques but also speedy – both MS and MS/MS sequence spectra can be acquired within seconds. Не само те двамата са чувствителни техники, но също така бързо - както MS и MS / MS последователност спектри могат да бъдат придобити в рамките на секунди. ESI and MALDI, due to their many differences, are complementary and many biopolymer laboratories have access to both techniques. ESI и МАЛДИ, поради тяхната много различия, са взаимно допълващи се и много biopolymer лаборатории, да имат достъп до двете техники.

Sample preparation: 2-Dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry Подготовката на пробите: 2 тримерно електрофореза и масова спектрометрия

Sample separation, isolation and preparation for the mass spectrometric techniques generally, involves 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), a technique that can separate as many as 5000 different proteins in a single experiment. Примерни разделяне, изолация и подготовката за масово спектрометричен техники като цяло, включва 2-DE (2-Dimenisional електрофореза), една техника, която може да отделни толкова, колкото е 5000 различни протеини в един експеримент. In general, 2-DE is capable of separating proteins within an isoelectric point (pI) range of 3.5–10 and of molecular masses ranging from 6 to 300 kDa, as well as being able to distinguish between post-translationally modified proteins (eg phosphorylated) and their non-modified companions. По принцип, 2-DE е в състояние да отделят белтъци в рамките на една isoelectric точка (Пи) кръг от 3.5-10 и на молекулно маси, вариращи от 6 до 300 kDa, както и да бъдат в състояние да направи разграничение между пост-translationally промяна на протеини (напр. phosphorylated ) И техните не са променени Съпровождащи. Once separated, the protein components are revealed by staining techniques (eg silver stain, fluorescent stain, Coomassie blue) and once located they can then be extracted from the gel. След като разделени на протеин съставки се разкриват петна от техники (напр. багрилно сребро, флуоресцентни багрилно, Coomassie синьо) и след близо тогава те могат да бъдат извлечени от гел. Proteins cannot easily be eluted from gels without the use of detergents, which are detrimental to the mass spectrometric analysis; additionally, large proteins tend to be heterogeneous (eg as a result of glycosylation) and so possesses no single molecular mass which can be related to the corresponding entry in a database. Протеини не може лесно да се елуират от гелове, без употребата на почистващи препарати, които са вредни за масово спектрометричен анализ; допълнително, големи протеини, са склонни да бъде разнообразен характер (например като резултат от glycosylation) и така не притежава едно молекулна маса, които могат да бъдат свързани с съответното вписване в базата данни. To overcome these obstacles, the elution step tends to be accomplished after the protein has been digested by an aqueous acetonitrile wash of an excised gel piece. За да се преодолеят тези препятствия, елуиращия стъпка може да се осъществи след протеин е digested с водна ацетонитрил измиване на excised гел парче. This increases the yield of extraction 5 and by using an in-gel digestion method employing trypsin, which has been described and is widely used as published or with minor modifications, produces a MS-compatible sample from which a protein identification can be made. Това увеличава добива на извличане на 5 и с помощта на по-гел храносмилането метод работят трипсин, което е било описано и е широко използван както са публикувани, или с незначителни изменения, произвежда MS-съвместими проба, от които протеин идентификация може да се направи. The digestion step can be preceded by an optional reduction and alkylation step to cleave and block disulfide bridges that exist between cysteine residues. В храносмилането стъпка може да бъде предшествано от едно желание за намаляване и alkylation стъпка към cleave и блок disulfide мостове, които съществуват между cysteine остатъци. Robotic systems have been developed to automate the excision of protein spots from the 2D-gel, to carry out the subsequent enzymatic digestion and to transfer the samples onto MALDI-MS target plates for the initial MS analysis. Автоматични системи са разработени за автоматизиране на ексцизия на протеини петна от 2D-гел, за извършване на последващи ензимно разлагане и за прехвърляне на проби в МАЛДИ-MS целеви табели за начална MS анализ. For many applications, the peptides recovered from in-gel digestions require concentration and purification before being analysed by mass spectrometry especially if ESI is the ionization method used. За много приложения, пептиди възстановени от по-гел digestions изисква концентрация и пречистване, преди да бъдат анализирани от масова спектрометрия особено ако ESI е йонизация използвания метод. Reversed phase high performance liquid Обрат фаза високоефективна течна
chromatography (HPLC) is one method of achieving this; another method involves the use of ZipTips (Millipore) (pipette tips packed with C18 material) or Poros R2 perfusion material (Perseptive Biosystems). хроматография (HPLC) е един метод за постигане на това; друг метод включва използването на ZipTips (Millipore) (пипета съвети опаковат с материал, С18) или Poros R2 перфузия материал (Perseptive Biosystems). Despite its widespread acceptance, the limitations of 2-DE include the exclusion of very small or very large proteins, very acidic or very basic proteins, as well as hydrophobic proteins such as membrane proteins. Въпреки широкото му приемане, ограниченията на 2-DE включват изключването на много малки или много големи белтъци, много кисели или много основни протеини, както и hydrophobic протеини като мембрана протеини. It is thought that Той е мисълта, че
only 20% of the gel-loaded proteins can be visualised and analysed. само 20% от гел-натоварени протеини могат да бъдат visualised и анализирана. Other constraints are that the amount of sample that can be loaded is limited causing the non-observance of Други фактори са, че размерът на пробата, която може да бъде заредена е ограничен причинява неспазване на
low concentration proteins and also that the most commonly used staining techniques have non-linear response factors. ниска концентрация на протеини, а също и че най-често използваните техники за оцветяване са нелинейна отговор фактори. In practice, 2-DE is a labour intensive process involving manual handling steps that offer the opportunity for impurities such as keratin to contaminate the samples. На практика, 2-DE е интензивен процес на труда, включващи ръчна обработка стъпки, които предлагат възможност за примеси, като например Кератин за замърсяване на пробите. One 2-D gel will take a day to complete and about one month for a complete structural analysis by MS, although automation can help both the contamination problem and speed up the analysis to some extent. Едно 2-D гел ще вземе един ден да завърши и около един месец за пълен анализ на структурните от г-жа, макар и автоматизация могат да помогнат както на замърсяване проблема и ускоряване на анализ, до известна степен.

Alternative protein separation techniques Алтернативните техники за отделяне протеин

Alternative, MS-compatible methods of protein preparation are under development but no one technology has emerged as a universal replacement. Алтернативно, MS-съвместими методи на протеин подготовка са в процес на развитие, но не една технология е ясно като универсална замяна. These methods aim generally to interface the protein sample directly to MS/MS analyses thereby eliminating time-consuming sample preparation steps and the need for a preliminary MS analysis. Тези методи обикновено се целят към интерфейса на протеин проба директно на MS / MS анализи, като по този начин елиминира времето, консумиращи подготовката на пробите стъпки и необходимостта от предварителния анализ на МС. Capillary isoelectric focusing (CIEF)-MS and preparative isoelectric focusing followed by size exclusion chromatography-MS are methods that have been compared in depth with 2-DE in terms of separation effciency, peak capacity, precision and robustness, with the former appearing the more favourable alternative.The direct analysis of complex peptide mixtures from a mixture of proteins using on-line, reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC)-MS/MS has been used successfully as an alternative to 2DE and this has led onto multidimensional chromatography if greater peptide separation is desirable prior to the MS/MS analyses. Капилярен isoelectric фокусиране (CIEF) и MS-препаративно isoelectric акцент следвани от размера изключване хроматография-MS са методи, които са били в сравнение с дълбочина 2-DE в смисъл на отделяне effciency, пикови мощности, прецизност и robustness, с бившия появява още благоприятни alternative.The пряк анализ на сложни пептид смеси от смес от протеини, използвайки он-лайн, върнат фаза високоефективна течна хроматография (HPLC) -MS/MS е бил използван успешно като алтернатива на 2DE и това е довело в много хроматография, ако пептид-голямо разделение е желателно преди да MS / MS анализи. Examples of two dimensional chromatography include anion or cation exchange followed by reversed phase HPLC and size exclusion chromatography followed by reversed phase HPLC. Примери за равнинната задача хроматография включват аниони или катиони, последвано от размяна обрат фаза HPLC и размера изключване хроматография, последвана от фаза HPLC обрат. Another, alternative approach has been to use combined solid-phase micro-extraction together with capillary electrophoresis(CE) coupled to ESI MS/MS for the analysis of a total protein tryptic digest. Друг, алтернативен подход е да се използва комбинирано-твърда фаза микро-добив, заедно с периферна електрофореза (CE), съчетано с ESI MS / MS за анализ на общ белтък tryptic дайджест. This method afforded high resolution separation of the peptide fragments allowing the identification of 80–90% of the proteins in this particular yeast ribosome complex. Този метод, предоставени с висока резолюция отделяне на пептид фрагменти, позволяваща идентификацията на 80-90% от протеини, в този конкретен дрожди рибозомата комплекс. Coupling microfluidic devices to MS is a further strategy that combines sample handling and separation, as well as interfacing neatly with nano-ESI-MS analysis.A different approach for selective protein fractionation and identification uses ProteinChip technology (Ciphergen) which employs a surface capture method using antibodies or chemically modified surfaces to capture specific classes of proteins which are then analysed by MALDI-MS. Microfluidic устройства за прикачване към МС е още една стратегия, която съчетава проба манипулиране и отделяне, както и interfacing хубаво с нано-ESI-MS analysis.A различен подход за подбор протеин, фракциониране и идентификация ProteinChip използва технология (Ciphergen), която използва метода за улавяне на площ използване на антитела или химически променени повърхности да улови конкретни класове на протеини, които след това се анализират от МАЛДИ-MS. This technique, known as Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI)-MS35, has great potential for the comparison of the protein content of different samples. Тази техника, известна като Повърхностни Засилено Лазерни десорбция йонизация (SELDI)-MS35, има голям потенциал за сравняване на съдържанието на протеин в различни проби.