Welcome to Molecular Station! Добре дошли в молекулярна станция!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Трябва да се регистрирате преди да можете да публикувате на нашите форуми, или да използвате допълнителни функции. Register Now! Регистрирайте се! Its Free and Fast! Тяхното свободно и бързо!

Already registered? Вече сте регистрирани? Login now below. Вход за сега по-долу.

User Name: Име:

Password: Парола:

Remember Me? Запомни ме?

Already registered and Forgot your password? Вече сте регистрирани и Забравили сте паролата си? Click below to recover it. Кликнете по-долу, за да го възстанови.

Recover Lost Password Забравена Забравена парола

Join now - it's fast and free! Присъединете се към момента - това е бързо и безплатно!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Молекулярна станция е най-голямата мрежа от изследователи, учени и любители на науката навсякъде!

Recent Forum Posts Нова Форум постове

DNA Protocols ДНК протоколи

DNA Encyclopedia ДНК енциклопедия

DNA Bioinformatics ДНК Биоинформатика

DNA Forum ДНК форум

DNA Blog ДНК Blog

DNA News ДНК Новини

DNA Books ДНК Книги

DNA Footprinting ДНК Footprinting

Copyright 2007 Molecular Station Copyright 2007 молекулярна станция

Background on DNA Footprinting Фон на ДНК Footprinting

DNase footprinting is a molecular biology method that enables the detection of DNA-protein interactions by exploiting the property that a protein interacting with DNA will protect the DNA at that interaction site from restriction digestion or DNAase enzymatic cleavage. DNase footprinting е молекулярна биология метод, който позволява откриване на ДНК-протеин взаимодействия, като се възползват от правата, които протеин взаимодейства с ДНК ще защити ДНК на това взаимодействие сайт от ограничаване на разлагане или DNAase ензимна cleavage. A DNA restriction fragment which contains the specific binding site is labeled at one end, usually with 32P and used for footprinting. Ограничаване на ДНК фрагмент, който съдържа конкретните задължителен сайт е означена на един край, обикновено с 32P и се използва за footprinting.

Protein and DNA are allowed to hybridize and bind together. Протеини и ДНК, на които е разрешено да hybridize и се свързват заедно.

DNA footprinting utilizes the enzyme DNase I or d eoxyribo n ucleic acid nucle ase I in order to digest or cut away free radiolabeled (or labelled) DNA leaving the protein bound DNA protected. ДНК footprinting използва ензим DNase І, или г eoxyribo н ucleic киселина nucle ЕКА І, с цел да дайджест или нарязани, далеч свободна radiolabeled (или етикетирани) ДНК напускане на протеин, обвързана с ДНК защитени. The DNA restriction fragments are treated lightly with DNase I, which makes single-strand breaks (nicks) in the DNA. ДНК фрагменти ограничение се третират с лека DNase I, което прави едно-нишка почивки (nicks) в ДНК. A small amount of enzyme is used such that there is an average of less than 1 nick/strand. Малка част от ензим се използва такъв, че има средно по-малко от 1 Ника / нишка. The reaction is then stopped, the DNA is denatured, and the mixture is run on a denaturing polyacrylamide sequencing gel. Реакцията след това е спрял, ДНК е денатуриран и сместа се движат по денатуриране секвениране полиакриламидна гел. These fragments separated by gel electrophoresis are exposed to detect the protected DNA area by analyzing the banding cleavage pattern on the gel. Тези фрагменти, разделени с гел-електрофореза са изложени за откриване на защитена зона с ДНК анализ на обкантване cleavage образец на гел.

The cleavage pattern of the DNA in the absence of a DNA binding protein, typically referred to as free DNA, is compared to the cleavage pattern of DNA in the presence of a DNA binding protein. В cleavage модел на ДНК, при липса на ДНК-свързващ белтък, обикновено по-нататък свободно ДНК, е сравнена с cleavage модел на ДНК, в присъствието на ДНК-свързващ белтък. If the protein binds DNA, the binding site is protected from enzymatic cleavage. Ако белтък се свързва с ДНК, на задължителен сайт е защитен от ензимна cleavage. This protection will result in a clear area on the gel which is referred to as the "footprint". Тази защита ще доведе до по-ясна площ на гел, който е посочен като "отпечатък".

By varying the concentration of the DNA-binding protein, the binding affinity of the protein can be estimated according to the minimum concentration of protein at which a footprint is observed. С различна концентрация на ДНК-свързващ белтък, свързването афинитет на протеин може да се изчислява в зависимост от минималната концентрация на протеини, в които се наблюдава отпечатък.

DNAse Footprinting Buffer Recipes DNAse Footprinting буфер рецепти

DNase Footprinting Binding Buffer Recipe DNase Footprinting задължителен буфер рецептата

2X w/o KCl / For 10mls: 2X без KCl / За 10mls:

amount: [final] размер: [окончателен]
Tris-HCl pH7.6: 500 ul of 1M: 50 mM Три-HCl pH7.6: 500 ул на 1M: 50 мм
MgCl2: 125ul of 1M: 12.5mM MgCl2: 125ul на 1M: 12.5mM
EDTA: 2 ul of 0.5M: 1mM EDTA: 2 на ул 0.5M: 1mM
Glycerol: 2 mls: 20% Глицерол: 2 МЛС: 20%
DTT : 10 ul of 1M: 1 mM DTT: 10 ул на 1M: 1 мм

Binding Buffer (Gel Shift buffer) Свързването на буфера (Gel Shift буфер)

5X w/o KCL 5 пъти без KCL
[final]: ingredient [окончателен]: съставка
20%: gylerol 20%: gylerol
5mM: MgCl2 5 мм: MgCl2
2.5mM: EDTA 2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT 2.5mM: DTT
250mM: NaCl 250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5 50mM: три-HCl, рН 7,5
0.25mg/ml: poly (dI-dC) poly (dI-dC) 0.25mg/ml: поли (ди-ПТ) полиароматни (ди-ПТ)

Ca/Mg Buffer Намирам / мг буфер

For 10mls За 10mls
CaCl2: 50 ul of 1M: 5 mM CaCl2: 50 ул на 1M: 5 мм
MgCl2: 100 ul of 1M: 10 mM MgCl2: 100 ул на 1M: 10 мм

Loading Solution Зареждане на решение
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v) 0,1 M: NaOH: formamid (1:2 обем / обем)
0.1%: xylene cyanol 0,1%: ксилен cyanol
0.1%: bromophenol blue 0,1%: bromophenol син

Stop Buffer Спиране на буфера
10mls
NaCl: 400 ul of 5M: 200 mM NaCl: 400 ул на 5 м: 200 мм
EDTA: 600 ul of 0.5M: 30 mM EDTA: 600 на ул 0.5M: 30 мм
SDS: 1 ml 10%: 1% SDS: 1 мл 10%: 1%

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.) TEBe (три-EDTA-бета mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6: 500 ul of 1 M: 50 mM Три-HCl, рН 7,6: 500 ул на 1 m: 50 мм
EDTA: 2ul of 0.5 M: 1 mM EDTA: 2ul на 0,5 М: 1 мм
Beta-mercaptoethanol: 10 ul : 15mM Бета-mercaptoethanol: 10 ул: 15mM

10 x K buffer 10 х К буфер
for 1 ml за 1 мл
Tris-HCl pH 7.5: 100 ul of 1 M: 100 mM Три-HCl рН 7,5: 100 ул на 1 m: 100 мм
MgCl2: 100 ul of 1 M: 100mM MgCl2: 100 ул на 1 m: 100 мм
DTT: 50 ul of 1M: 50 mM DTT: 50 ул на 1M: 50 мм
dH2O: 750 ul dH2O: 750 ул

DNAse Footprinting Protocol DNAse Footprinting Протокол

The DNA used usually contains the binding site of your protein of interest. ДНК, използвани обикновено съдържа задължителни сайт на протеин на Вашия интерес. The DNA is purified, then digested with restriction fragments to be of an appopriate size. ДНК е пречистена, а после digested с ограничение да бъде фрагменти от едно appopriate размер. The DNA fragment is labeled on one end (binding site > 25 bp from end). ДНК фрагмент е с надпис върху една цел (задължителен сайт> 25 от крайни bp).

One strand labeling can be accomplised by: Една нишка може да се етикетира accomplised от:

1. isolating the fragment with restriction enzyme(s) containing 5' overhang, labeling with Klenow and the appropriate hot nucleotide. изолиране на фрагмент с ограничение ензим (а), съдържащ 5 'част, етикетиране с Klenow и съответните горещо нуклеотидни. Then digest with an enzyme that removes one end. После дайджест с ензим, че премахва една цел.
2. isolating a fragment digested with a restriction enzyme that creates 5' and 3' end, labeling with Klenow will only label the 5' overhang. изолиране фрагмент digested с ограничение ензим, което създава 5 'и 3' края, етикетиране с Klenow само ще етикет, на 5 'част.
3. As in "a" but with any enzyme and using polynucleotide kinase to label 3' end (kinase) and digesting off one of the ends with a second (third) restriction enzyme. Както и в "а", но с всеки ензим и използване на polynucleotide киназа на етикета 3 'края (киназа) и digesting на разстояние един от завършва с втори (трети) ограничаване ензим.
   (REMINDER: if labeling with Klenow, at the end of reaction add an excess of cold nucleotide of the same nucleotide that is labeled ( ie if you use dCTP32, add dCTP at the end) to make sure all ends are filled in equally. (Напомняне: ако етикетира с Klenow, в края на реакцията добавите повече от студ нуклеотидни на една и съща нуклеотидни, която е означена като (т.е., ако използвате dCTP32, добавете dCTP в края), за да сте сигурни, че всички цели са напълнени в еднаква степен.

For Klenow fragments, 0.3ug bring up to 100 ul in TE, heat kill Klenow at 68 °C for 10 minutes. За Klenow фрагменти, 0.3ug въвеждат до 100 ул по ТЕ, топлина убие Klenow на 68 ° С в продължение на 10 минути.

LABELING with one 5' overhang Етикетни с един 5 'част

Sample RXN : 15 ng is need for each reaction. Примерни RXN: 15 на е необходимо за всяка реакция. If making probe for many reactions JUST increase amount of DNA up to 300 ngs. В случай на вземане на проби за много реакции JUST увеличаване на размера на ДНК до 300 ngs.
15ng: DNA fragment 15ng: ДНК фрагмент
2 ul: 10x K buffer 2 ул: 10x K буфер
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul 5 ул: 32P dCTP 3,33 за колективни инвестиции 10 / ул
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP 2 ул: 2mM @ добър, консумация на dTTP
1 ul: Klenow 1 ул: Klenow
20 ul Final volume, 37°C 30 min. 20 ул Заключителни обем 37 ° C 30 мин.
--add 1 ul 10mM dNTP, 5 min @ 37°C . -- добавяне на 1 ул 10 mm dNTP, 5 мин. @ 37 ° C.

--add 80 ul TE. -- добави 80 ВЕ, ул. 68°C 15 minutes, put on ice. 68 ° C 15 минути, пуснати на лед.
--G-50 Spin Column (spin at about 2000g) -- G-50 Спин колона (Сервиз на около 2000 грама)
--ADD 1/10 vol 3M Na0Ac, 2.5 volumes EtOH, Ice 30 mins, (Optional if [DNA] is = or > 3 ng/ul you might post G-50 directly) Microfuge 30 minutes. -- Добавете 1 / 10 об 3M Na0Ac, 2,5 обеми EtOH, лед 30 мин., (по избор, ако [ДНК] е = или> 3 на / ул бихте могли да публикувате директно G-50) Microfuge 30 минути.
--wash with 70% -- измиване с 70%
--Dry Bring up in 5ul -- Сухо Bring в 5ul

Binding Reaction For DNase Footprinting Обвързващата реакция за DNase Footprinting

Binding Reaction should have between 10 and 150mM KCl (more salt reduces binding but increases specificity). Обвързващата реагиране трябва да са между 10 и 150mM KCl (повече сол намалява задължителен, но се увеличава специфичността). The typical concentration is 50mM. В типичния концентрацията е 50mM.

Protein DNA Binding: Протеин ДНК задължителен:
25 ul of 2X Binding Buffer w/o KCl 25 на ул 2X Свързването на буфера без KCl
5ul of 3 ng/ul unilabeled DNA 5ul от 3 на / ул unilabeled ДНК
X ul of KCl to equal 10-150 mM KCl X ул на KCl за равен 10-150 мм KCl
dH20 to equal 50 ul minus volume for binding protien dH20 до 50 равни ул минус за задължителен обем protien
1-3 Footprinting Units of DNA binding protein (or 10 to 160 ug of Crude nuclear extract) 1-3 Footprinting звена на ДНК-свързващ белтък (или от 10 до 160 ug на суров ядрената извлечение)

--mix gently, ice 10 minutes. -- микс внимателно, лед 10 минути.

KEEP TIMING IN MIND, Съхранява на времето се има предвид,
--ADD 50 ul of RT Ca/Mg solution, 18°C for 1 minute. -- ADD 50 ул на RT БКПЗ / Mg разтвор, 18 ° С в продължение на 1 минута.
--ADD 3 ul dilute RQ1 DNase (0.05 u/ul diluted in Tris) INCUBATE 1 minute. -- Добавете 3 ул размиване RQ1 DNase (0,05 и / ул разреден в три) INCUBATE 1 минута.
--STOP addition of 90 with 37°C STOP solutions, -- Прекратява добавянето на 90 с 37 ° C STOP решения,

--you should Phenol: CIA, and CIA extract, and Ethanol precipitate. -- Вие би трябвало да фенол: ЦРУ, и екстракт от ЦРУ, и Етанол утайка.
--RESUSPEND in 4ul of Loading Solution. -- RESUSPEND в 4ul на натоварване решение.
--Run on 5% standard Urea-DNA sequencing gel (consider wedge gel) with appopriate loading lanes such as DNA ladder, uncut DNA, and controls. -- Пусни на 5% стандарт карбамид-ДНК секвениране гел (обмислят клин гел) с appopriate зареждането на ленти, като ДНК лика, uncut ДНК, както и контрол.

Analyze footprinting pattern. Анализирайте footprinting модел.

Troubleshooting and Problems? Отстраняване на проблеми и проблеми? See the DNAse Footprinting Forum! Вижте DNAse Footprinting форум!

For problems and troubleshooting DNAase footprinting, post a new thread to discuss it in the DNA Footprinting Forum ! За проблеми и отстраняване на неизправности DNAase footprinting, след нова тема за обсъждане, че в ДНК Footprinting форум!

Other DNA Protocols and Methods Други ДНК, протоколи и методи

DNA Cloning Guide ДНК клониране гид

DNA Gel Electrophoresis ДНК гел-електрофореза

Restriction Enzyme Digestion - all you need to know ! Ограничаване Ензим храносмилането - всичко, което трябва да знаете!

Genomic DNA Isolation Protocol Genomic протокол за изолиране на ДНК

Baceteria DNA Isolation Baceteria ДНК изолиране

DNA Transformation - Contains History of DNA ДНК трансформация - съдържа историята на ДНК

Find other protocols at our DNA Protocols external resource directory or see our DNA protocols . Намерете други протоколи в нашата ДНК протоколи външен ресурс директория или вижте нашата ДНК протоколи.

Related: Свързани:

DNA Microarray Protocols ДНК Microarray протоколи

PCR Protocols PCR протоколи

DNA Bioinformatics ДНК Биоинформатика

Visit DNA Bioinformatics . Посещение на ДНК биоинформатиката.

DNA-Related News ДНК-новини, свързани с

DNA News ДНК Новини