لطخة غربيّة

الآن علمت كلّ شيء وإلّا هناك حول لطخات غربيّة!

- عينة [بربرتأيشن]

- [لز] مصعد

- جسم

- [لز] خلايا

- هلام تحضير

- يركض هلام

- إنتقال الهلام

- تحكّم

- لطخة غربيّة

- عملّيّة فصل

- تحليل وتفسير

ما إذا يتلقّى أنت خلايا [نون-دهرنت] (مثل [ت-سلّ] خطوط أو [بلوود سلّ] محيطيّ) أو خلايا لزجة (مثل خليّة ليفيّة خلايا أو [كس] خلايا), أنت تحتاج أن يزيل بروتينات غريب من الأوساط. لخلايا [نون-دهرنت] أنت يستطيع بلطف كوّنتهم مع طرد مركزيّ وبعد ذلك غسلت الكريّة طينيّة مع [ببس]. لخلايا لزجة, غسل بسيطة القارورة أو طبق مع [ببس] قبل لطخة غربيّة.

غربيّة لطخة يفحص تحليل بروتينات, ولذلك نحن نريد البروتينات أن يكون إطلاق من الخلايا وأيضا منعت البروتينات من يكون يقطع فوق بأنزيم بروتينيّ. نحن نحتاج هذا إلى لطخة غربيّة:

- أن يحافظ أشياء باردة! [4ك] على جليد أثناء خلية تفسّخ لغربيّة يلطّف

- استعملت [دترجنت] أن يكسر فوق أغشية الخلايا أن يطلق بروتينات

- مصعد

- صادّ (على حدّ سواء أنزيم بروتينيّ صادّ وفوسفتاز صادّ إن نحن سنتمّ لطخة غربيّة ل [فوسفو-بروتينس])

منظّفة - [لز] خلايا للطخة غربيّة

[سدس] و [ريبا] [دترجنت] أنّ يكون استعملت أن [سلوبيليز] بروتينات لتحليل متأخّر يستعمل غربيّة يلطّف. هذا تطلّبت [أس مني] بروتينات إمّا في الخلية أو يحدّد داخليّ خلية أغشية, لذلك يحتاج نحن أن يطلق هذا بروتينات أن يكون يمكن إلى [إيمّونوبلوت] ل هم.

أنت سوفت انتقيت جسم أن يستعمل للطخة غربيّة. عادة إمّا فأرة استعملت أجسام [مونوكلونل] أو أرنب [بولكلونل] أجسام.

استعملت أنت يستطيع استعملت إمّا جسم دون أيّ يضاف مجموعة, أو جسم أيّ يكون صرّحت إلى بيوتين. لا يتطلّب هذا أجسام

[بولكلونل] [فس] أجسام [مونوكلونل] للطخة غربيّة

أجسام [مونوكلونل] عادة جيّدة لغربيّة يلطّف واجبة إلى:

- جيّدة [سنل تو نويس] نسبة (خلفيّة [لوور] في لطخة غربيّة)

- نوعيتهم [هيغر] (يحصل أنت أقلّ يلوّن بروتينات أو [إيغ])

- إجماليّة منظف نتيجات على الغربيّة يلطّف فيلم (نطق [نون-سبسفيك] أقلّ يكشف)

[بولكلونل] تناسبت أجسام على نحو أفضل لترسّب مناعيّ:

- يميّز هم كثير [إبيتوب]

- تلقّيت جشع [هيغر]

[لز] أطراف قبل أنت لغربيّة يلطّف:

إن أنت يكون تذهب إلى لطخة غربيّة لبروتين كتلة ([إي] بروتين أنّ ليس [فوسفورلتد]):

- أنت يستطيع [لز] في حجوم كبيرة (يحافظ الإستراحة أن يلطّف لأخرى بروتينات)

إن أنت يكون تذهب إلى لطخة غربيّة [فوسفو-بروتين] (أو بروتين [فوسفورلتد]) هو مهمّة أن يتمّ التالي:

- تتأكّد أنت إستعمال فوسفتاز صادّ (مثل [فندت] لأنّ فوسفتاز سيزيلون الفسفات من بروتيناتك! )

[لز] - أيضا خلايا في الحجم صغيرة يمكن ([إي] [لز] في 100 [أول] تحميل مصعد, هذا أتمّت لأنّ أنت يستطيع حمّلت أكثر من الخلايا أنت [لز]. هذا مهمّة بما أنّ إشارة يكون الى حدّ بعيد ضعيفة عندما غربيّة يلطّف ل [فوسفو-بروتينس].)

إن أنت يكون تنظر في [بروتين-بروتين] تفاعل:

لا يستعمل - [سدس] بما أنّ هو يتفكّك [بروتين-بروتين] تفاعل ولذلك بروتينات يكون شوّهت (خصوصا بعد يغلي)

- لغربيّة يلطّف [بروتين-بروتين] تفاعل, [إي] تفاعل أهليّ طبيعيّ أنت ينبغي استعملت [دترجنت] [لسّ-سترينجنت] هذا [ريبا].

[لز]:

- يستطيع كنت أتمّت مباشرة على اللوحة أو طبق

- كوّنت الخلايا

استعملت - حافظت على جليد وبريد - [إيس بوكت]

- [رول وف ثومب] ل [هوو موش] تفسّخ مصعد أن يستعمل يكون: 10^5 خلايا/[أول] من تفسّخ مصعد

حافظت - جمعت في [إبّندورف] أنبوب وعلّبت (هذا على جليد)

قست [توتل بروتين] قبل غربيّة لطخة تحليل:

- يسمح هذا أكثر تحليل كمّيّة إن أنت تريد أن يقارن معالجة شرط في غربيّة لطخة تحليل

- عدّة تجاريّة يتوفّر مثل برادفورد فحص ل يقيس [توتل بروتين] (من [بيو-رد])

- 0.1% من [سدس] أو عظيمة يستطيع تدخّلت مع بروتين قياس

شوّهت بروتين عينات:

يحتوي - أضفت بروتين تحميل عينة مصعد إلى قادمة من خلية [لست] - صبغ (أيضا رأيت الهجرة على هلام, 2% [سدس])

- أضفت ثاني كبريتيد [ردوس جنت] مثل [بتا] - [مركبتوثنول]

- غليان في [وتر-بث] أو تدفئة قالب ([لوور تمبرتثر] مثل منتصفة - 90 ينخفض درجات بروتين تراكم).

- دفعت فتحة بئر في غطاء من كلّ أنبوب أن يمنع يفرقع

[سدس-بج] هلامات هلام مادّة ترابط أيّ يكون استعملت أن يفصل بروتينات بحجم بحضور تيار كهربائيّ. منخفضة نسبة مئويّة يفصل هلامات بروتينات كبيرة حيث أنّ [هيغر] نسبة مئويّة هلامات يفصلون بروتينات صغيرة على نحو أفضل. المشكلة أنّ يتلقّى كلّ بروتينات يحمّل موحّدة مع هم, وفي تيار كهربائيّ هذا استطاع سبّبت مشكلة. هذا حللت بالإضافة ال [سدس] إلى البروتين عينات. [سدس] يقيّد إلى بروتينات كلّ قليل من [أمينو سد] ويحايد الحشوة فروق أنّ بروتينات يتلقّون. هذا يسمح بروتينات أن يكون فصلت بحجم ولا بحشوة.

- [دبندينغ ون] [هوو موش] بروتين أنت ستريد أن يحمّل لغربيّة يلطّف, أنت سوفت استعملت مشورات صغيرة أو مشورات كبيرة.

- النسبة مئويّة ال [أكرلميد] مهمّة. عادة 10% استعملت [أكرلميد].

- استعملت يحلّ هلام في القعر مع [ف] من 8.8

- استعملت يكدّس هلام (4-5%) [ف] 6.8 أن يحزم بروتينات داخل معا بعد يحمّل

- زدت بلمرة الهلامات بالمادّة حفّازة [أبس] و [تمد] أيّ يعجّل البلمرة ردّ فعل (تشكيل وتجميد) من ال [بول-كرلميد جل].

- حمّلت كلّ عينة بعناية وببطء أن يمنع عينة يتسرّب من الدرج.

- حمّلت كلّ درج واستعملت عينة مصعد في كلّ (أن يمنع فروق داخل).

1. طردت عينات ل 10 [سك] بعد يغلي.
2. حمّلت عينة داخل كلّ درب
3. حمّلت [مو] مرجع
4. ركضت هلام في [100ف] (جهد فلطيّ ثابت) [أر فن] حسنت في 40 [ما] (تيار ثابت). راقبت بروتين علامة/سلم أو صبغت جبهة ل متى أن يتوقّف هلام. يعطي تيار ثابت جيّدة ونتيجات حادّ إن أنت تتلقّى الوقت.

- ساعة لفقاقيع بين زجاج وتحت الهلام - يعني هذا أنّ هو يعمل

- ساعة لبروتين هجرة (سوفت كنت ذهبت إلى أسفل) - [إيف نوت] قد حوّل أنت ال [لدس] ويستطيع خسرت كلّك عينات!

ركضت - في البداية ببطء من خلال ال يكدّس هلام (~ 50 فولت), هذا يعطي نطق حادّ.

لا يركض - بين عشيّة وضحاها

لا [أفر-هت] - الهلام (هذا يسبّب الهلام أن يخسر صلابة, يقود إلى فقراء [رسلوفينغ] و [بلورّي] على نحو رديء يشكّل نطق)

انتقيت غشاء نوع:

يستطيع استعملت أحد:

- [بفدف] غشاء للطخات غربيّة

- [نيتروسلّولوس] غشاء للطخات غربيّة

- غشاء من نايلون (نادرا يستعمل الآن - يستطيع مزّقت)

أطراف ل [ترنسفرّينغ] إلى غشاء غربيّة:

- لباس قفازات دائما! استعملت ملقط

- قلّلت يلمس/ملقط إلى الغشاء

[بيو-رد] إنتقال أمر:

(-)
إسفنجة على أسود
[فيلتر ببر]
هلام [نيتروسلّولوس]
[فيلتر ببر]
إسفنجة
(+)

إنتقال:

- حافظت باردة في [4ك]

- إنتقال بين عشيّة وضحاها في 35 [ف]

- يستطيع نقلت سريعا في 1 ساعة في [ف] [هيغر]

يسمح يسدّ من أغشية أنت أن يزيد إشارة: ضوضاء نسبة

- لباس قفازات

- قالب مع 5% [بلوتّو] (لبن منزوع منه الدهن جادّة - مسحوق) أو 1 - 5% [بسا] ([بوفين سروم] زلال) لبروتينات [فوسفورلتد].

- مصعد [تبست]

يغسل بعد يسدّ

- ليس يغسل بعد يسدّ [ستبس] حرج, بما أنّ الناس غالبا قالب أثناء أوّليّة جسم حضانة.

- أتمّت غسل عادة مع [تبست] مصعد. يستطيع كنت أتمّت سريعا مع [لرج فولوم] من [تبست].

حضانة مع جسم أوّليّة

- فأرة, أرنب أو أخرى نوع

- عادة 1: 1000 تخفيف مع [تبست]

- إن [هي بكغرووند]/كثير نطق [نون-سبسفيك] يكون مشكلة, حضانة يستطيع كنت أتمّت مع 5% [بسا] أو لبن.

يغسل بعد جسم أوّليّة

- لا هكذا حرج

- يستطيع غسلت سريعا مع حجوم كبيرة [تبست]

حضانة من جسم ثانويّة

- عادة يخفّف 1: 10, 000 مع [تبست]

- [أنتي-مووس], [أنتي-ربّيت], أو أخرى جسم يصرّح مع [هرب] أنزيم لكشف

يغسل بعد جسم ثانويّة

- حرج

- غسل 5 [إكس] ل 5 دقائق مع [تبست].

- إن أنت حقّا ينبغي استعجلت, غسلت على الأقلّ 3 أوقات مع حجوم كبيرة [تبست].

يعاير لنتيجات

- عادة استعملت [إكل] (يحسن ضياء كيميائيّ)

- عرضت فيلم وطوّلت. انكشاف ل 10 ثانية عادة بكفاية ل [توتل بروتين]. [فوسفو-بروتينس] يستطيع تطلّبت 2 - 20 انكشاف دقيقة.

- فيلم عادة [إكسومت] أو مماثلة "سريعة" فيلم

[وب] - لطخة غربيّة

[إيب] - [إيمّونوبلوت] (آخر عبارة لغربيّة يلطّف)

[سدس] - [دودسل سولفت] ([دترجنت] يستعمل في كثير غربيّة يلطّف حلّ)

صفحة - [بولكريلميد] هلام إستشراد

[أب] - جسم (استعملت أجسام أن يكشف بروتينك الفائدة)

[هرب] - [هورس رديش] [بروإكسيدس]

[لومينول] - طبقة سفليّة أنّ [هرب] يفرج أن يسبّب تشكيل خفيفة

[إكل] - يحسن ضياء كيميائيّ (غربيّة لطخة حلّ أيّ يحسن تشكيل خفيفة من [هرب]+[لومينول])

[كد/كدا] - [كيلودلتون] (كثير بروتينات معدّل بين 30 - 80 [كدا])

مطرقة - أرنب [أنتي-مووس] [إيغ]

[إيغ] - كروين مناعيّ (جسم [إيستب])

[نب-40] - [نونيدت] [ب-40]

[بمسف] - [فنلمثلسولفونل] فلوريد

[بسا] - [بوفين سروم] زلال

[نفدم] - لبن منزوع منه الدهن جادّة