لطخة غربيّة

الآن علمت كلّ شيء وإلّا هناك حول لطخات غربيّة!

- عينة [بربرتأيشن]

- [لز] مصد

- جسم

- [لز] خلايا

- هلام تحضير

- يركض هلام

- إنتقال الهلام

- تحكمات

- لطخة غربيّة

- عملّيّة فصل

- تحليل وتفسير

ما إذا يتلقّى أنت خلايا [نون-دهرنت] (مثل [ت-سلّ] خطوط أو [بلوود سلّ] محيطية) أو خلايا لزجة (مثل خليّة ليفيّة خلايا أو [كس] خلايا) ، أنت تحتاج أن يزيل بروتينات غريبة من الأوساط. لخلايا [نون-دهرنت] أنت يستطيع بلطف كوّرتهم مع طرد مركزيّ وبعد ذلك غسلت الكريّة طينيّة مع [ببس]. لخلايا لزجة ، غسل بسيط القارورة أو طبق مع [ببس] قبل لطخة غربيّة.

غربيّة لطخة يفحص تحليل بروتينات ، ولذلك نحن نريد البروتينات أن يكون إطلاق من الخلايا وأيضا منعت البروتينات من يكون يقطع فوق بأنزيم بروتينيّ. نحن نحتاج هذا إلى لطخة غربيّة:

- أن يحافظ أشياء باردة! [4ك] على جليد أثناء خلية تفسخ لغربيّة يلطّخ

- استعملت [دترجنت] أن يكسر فوق أغشية الخلايا أن يطلق بروتينات

- مصد

- صادّ (على حدّ سواء أنزيم بروتينيّ صادّ وفوسفتاز صادّ إن نحن سنتمّ لطخة غربيّة ل [فوسفو-بروتينس])

منظّفة - [لز] خلايا للطخة غربيّة

[سدس] و [ريبا] [دترجنت] أنّ يكون استعملت أن [سلوبيليز] بروتينات لتحليل متأخّرة يستعمل غربيّة يلطّخ. هذا تطلّبت [أس مني] بروتينات إمّا في الخلية أو يحدّ داخليّة خلية أغشية ، لذلك يحتاج نحن أن يطلق هذا بروتينات أن يكون يمكن إلى [إيمّونوبلوت] ل هم.

أنت سوفت انتقيت جسم أن يستعمل للطخة غربيّة. عادة إمّا فأرة استعملت أجسام [مونوكلونل] أو أرنبة [بولكلونل] أجسام.

استعملت أنت يستطيع استعملت إمّا جسم دون أيّ يضاف مجموعة ، أو جسم أيّ يكون صرّحت إلى بيوتين. لا يتطلّب هذا أجسام

[بولكلونل] [فس] أجسام [مونوكلونل] للطخة غربيّة

أجسام [مونوكلونل] عادة جيّدة لغربيّة يلطّخ واجبة إلى:

- جيّدة [سنل تو نويس] نسبة (خلفيّة [لوور] في لطخة غربيّة)

- نوعيتهم [هيغر] (يحصل أنت أقلّ يلوّث بروتينات أو [إيغ])

- إجماليّة منظفة نتيجات على الغربيّة يلطّخ فيلم (نطق [نون-سبسفيك] أقلّ يكشف)

[بولكلونل] تناسبت أجسام على نحو أفضل لترسّب مناعيّ:

- يميّز هم كثير [إبيتوب]

- تلقّيت جشع [هيغر]

[لز] أطراف قبل أنت لغربيّة يلطّخ:

إن أنت يكون تذهب إلى لطخة غربيّة لبروتين كتلة ([إي] بروتين أنّ ليس [فوسفورلتد]):

- أنت يستطيع [لز] في حجوم كبيرة (يحافظ الإستراحة أن يلطّخ لأخرى بروتينات)

إن أنت يكون تذهب إلى لطخة غربيّة [فوسفو-بروتين] (أو بروتين [فوسفورلتد]) هو مهمّة أن يتمّ التالي:

- تتأكّد أنت إستعمال فوسفتاز صادّ (مثل [فندت] لأنّ فوسفتاز سيزيلون الفسفات من بروتيناتك! )

[لز] - أيضا خلايا في الحجم صغيرة يمكن ([إي] [لز] في 100 [أول] تحميل مصد ، هذا أتمّت لأنّ أنت يستطيع حمّلت أكثر من الخلايا أنت [لز]. هذا مهمّ بما أنّ إشارة يكون الى حدّ بعيد ضعيفة عندما غربيّة يلطّخ ل [فوسفو-بروتينس].)

إن أنت يكون تنظر في [بروتين-بروتين] تفاعلات:

لا يستعمل - [سدس] بما أنّ هو يتفكّك [بروتين-بروتين] تفاعلات ولذلك بروتينات يكون شوّهت (خصوصا بعد يغلي)

- لغربيّة يلطّخ [بروتين-بروتين] تفاعلات ، [إي] تفاعلات أهليّ طبيعيّ أنت ينبغي استعملت [دترجنت] [لسّ-سترينجنت] هذا [ريبا].

[لز]:

- يستطيع كنت أتمّت مباشرة على اللوحة أو طبق

- كوّرت الخلايا

استعملت - حافظت على جليد وبريد - [إيس بوكت]

- [رول وف ثومب] ل [هوو موش] تفسخ مصد أن يستعمل يكون: 10^5 خلايا/[أول] من تفسخ مصد

حافظت - جمعت في [إبّندورف] أنابيب وعلمت (هذا على جليد)

قست [توتل بروتين] قبل غربيّة لطخة تحليل:

- يسمح هذا أكثر تحليل كمّيّ إن أنت تريد أن يقارن معالجة شروط في غربيّة لطخة تحليل

- عدد تجاريّ يتوفّر مثل برادفورد فحص ل يقيس [توتل بروتين] (من [بيو-رد])

- يتدخّل 0.1% من [سدس] أو علبة عظيمة مع بروتين قياس

شوّهت بروتين عينات:

يحتوي - أضفت بروتين تحميل عينة مصد إلى قاسمة من خلية [لست] - صبغ (أيضا رأيت الهجرة على هلام ، 2% [سدس])

- أضفت ثاني كبريتيد [ردوس جنت] مثل [بتا] - [مركبتوثنول]

- غليان في [وتر-بث] أو تدفئة قالب ([لوور تمبرتثر] مثل منتصفة - 90 ينخفض درجات بروتين تراكم).

- دفعت فتحة بئر في غطاء من كلّ أنابيب أن يمنع يفرقع

[سدس-بج] هلامات هلام مادّة ترابط أيّ يكون استعملت أن يفصل بروتينات بحجم بحضور تيار كهربائيّ. منخفضة نسبة مئويّة يفصل هلامات بروتينات كبيرة حيث أنّ [هيغر] نسبة مئويّة هلامات يفصلون بروتينات صغيرة على نحو أفضل. المشكلة أنّ يتلقّى كلّ بروتينات يحمّل موحّدة مع هم ، وفي تيار كهربائيّ هذا استطاع سبّبت مشاكل. هذا حللت بالإضافة ال [سدس] إلى البروتين عينات. [سدس] يقيّد إلى بروتينات كلّ قليل من [أمينو سد] ويحايد الحشوة فروق أنّ بروتينات يتلقّون. هذا يسمح بروتينات أن يكون فصلت بحجم ولا بحشوة.

- [دبندينغ ون] [هوو موش] بروتين أنت ستريد أن يحمّل لغربيّة يلطّخ ، أنت سوفت استعملت مشاط صغيرة أو مشاط كبيرة.

- النسبة مئويّة ال [أكرلميد] مهمّة. عادة 10% استعملت [أكرلميد].

- استعملت يحلّ هلام في القعر مع [ف] من 8.8

- استعملت يكدّس هلام (4-5%) [ف] 6.8 أن يحزم بروتينات داخل معا بعد يحمّل

- زدت بلمرة الهلامات بالمادّة حفّازة [أبس] و [تمد] أيّ يعجّل البلمرة ردّ فعل (تشكيل وتجميد) من ال [بول-كرلميد جل].

- حمّلت كلّ عينة بعناية وببطء أن يمنع عينة يتسرّب من الدرب.

- حمّلت كلّ درب واستعملت عينة مصد في كلّ (أن يمنع فروق داخل).

1. طردت عينات ل 10 [سك] بعد يغلي.
2. حمّلت عينة داخل كلّ درب
3. حمّلت [مو] مرجع
4. ركضت هلام في [100ف] (جهد فلطيّ ثابتة) [أر فن] حسنت في 40 [ما] (تيار ثابتة). راقبت بروتين علامة/سلم أو صبغت جبهة ل متى أن يتوقّف هلام. يعطي تيار ثابتة جيّدة ونتيجات حادّة إن أنت تتلقّى الوقت.

- ساعة لفقاقيع بين زجاج وتحت الهلام - يعني هذا أنّ هو يعمل

- ساعة لبروتين هجرة (سوفت كنت ذهبت إلى أسفل) - [إيف نوت] قد حوّل أنت ال [لدس] ويستطيع خسرت كلّك عينات!

ركضت - في البداية ببطء من خلال ال يكدّس هلام (~ 50 فوط) ، هذا يعطي نطق حادّة.

لا يركض - بين عشيّة وضحاها

لا [أفر-هت] - الهلام (هذا يسبّب الهلام أن يخسر صلابة ، يقود إلى فقراء [رسلوفينغ] و [بلورّي] على نحو رديء يشكّل نطق)

انتقيت غشاء نوع:

يستطيع استعملت أحد:

- [بفدف] غشاء للطخات غربيّة

- [نيتروسلّولوس] غشاء للطخات غربيّة

- غشاء من نايلون (نادرا يستعمل الآن - يستطيع مزّقت)

أطراف ل [ترنسفرّينغ] إلى غشاء غربيّة:

- لباس قفازات دائما! استعملت ملقط

- قلّلت يلمس/ملقط إلى الغشاء

[بيو-رد] إنتقال أمر:

(-)
إسفنجة على أسود
[فيلتر ببر]
هلام [نيتروسلّولوس]
[فيلتر ببر]
إسفنجة
(+)

إنتقال:

- حافظت باردة في [4ك]

- إنتقال بين عشيّة وضحاها في 35 [ف]

- يستطيع نقلت سريعا في 1 ساعة في [ف] [هيغر]

يسمح يسدّ من أغشية أنت أن يزيد إشارة: ضوضاء نسبة

- لباس قفازات

- قالب مع 5% [بلوتّو] (لبن منزوع منه الدهن جافّة - مسحوق) أو 1 - 5% [بسا] ([بوفين سروم] زلال) لبروتينات [فوسفورلتد].

- مصد [تبست]

يغسل بعد يسدّ

- ليس يغسل بعد يسدّ [ستبس] حرجة ، بما أنّ الناس غالبا قالب أثناء أوّليّة جسم حضانة.

- أتمّت غسل عادة مع [تبست] مصد. يستطيع كنت أتمّت سريعا مع [لرج فولوم] من [تبست].

حضانة مع جسم أوّليّة

- فأرة ، أرنبة أو أخرى نوع

- عادة 1: 1000 تخفيف مع [تبست]

- إن [هي بكغرووند]/كثير نطق [نون-سبسفيك] يكون مشكلة ، حضانة يستطيع كنت أتمّت مع 5% [بسا] أو لبن.

يغسل بعد جسم أوّليّة

- لا هكذا حرجة

- يستطيع غسلت سريعا مع حجوم كبيرة [تبست]

حضانة من جسم ثانويّة

- عادة يخفّف 1: 10 ، 000 مع [تبست]

- [أنتي-مووس] ، [أنتي-ربّيت] ، أو أخرى جسم يصرّح مع [هرب] أنزيم لكشف

يغسل بعد جسم ثانويّة

- حرجة

- غسل 5 [إكس] ل 5 دقائق مع [تبست].

- إن أنت حقّا ينبغي استعجلت ، غسلت على الأقلّ 3 أوقات مع حجوم كبيرة [تبست].

يعاير لنتيجات

- عادة استعملت [إكل] (يحسن ضياء كيميائيّ)

- عرضت فيلم وطوّرت. انكشاف ل 10 ثانية عادة بكفاية ل [توتل بروتين]. [فوسفو-بروتينس] يستطيع تطلّبت 2 - 20 انكشاف دقيقة.

- فيلم عادة [إكسومت] أو مماثلة "سريعة" فيلم

[وب] - لطخة غربيّة

[إيب] - [إيمّونوبلوت] (آخر عبارة لغربيّة يلطّخ)

[سدس] - [دودسل سولفت] ([دترجنت] يستعمل في كثير غربيّة يلطّخ حلول)

صفحة - [بولكريلميد] هلام إستشراد

[أب] - جسم (استعملت أجسام أن يكشف بروتينك الفائدة)

[هرب] - [هورس رديش] [بروإكسيدس]

[لومينول] - طبقة سفليّة أنّ [هرب] يفرج أن يسبّب تشكيل خفيفة

[إكل] - يحسن ضياء كيميائيّ (غربيّة لطخة حل أيّ يحسن تشكيل خفيفة من [هرب]+[لومينول])

[كد/كدا] - [كيلودلتون] (كثير بروتينات معدل بين 30 - 80 [كدا])

مطرقة - أرنبة [أنتي-مووس] [إيغ]

[إيغ] - كروين مناعيّ (جسم [إيستب])

[نب-40] - [نونيدت] [ب-40]

[بمسف] - [فنلمثلسولفونل] فلوريد

[بسا] - [بوفين سروم] زلال

[نفدم] - لبن منزوع منه الدهن جافّة