[ركمبيننت] بروتين تعبير

حقّ نشر © محطة جزيئيّة 2006

عندما يريد أنت أن يميّز مورثة أو بروتين الفائدة, أنت ينبغي أولى درست عمله. في هذا عصر جزيئيّة, ليس ينال [كدنا] من مورثتك الفائدة يصعب.

أن عبّر عن ال [كدنا] كبروتين, [إي]. بروتين [ركمبيننت], واحدة يستطيع بعد ذلك بسهولة أنجزت دراسات وظيفيّة يستعمل ال [ركمبيننت] يصفّى بروتين.

ما إن أنت تتلقّى يصفّى بروتين أنت يستطيع أوصلت:

[بروتين-بروتين] تفاعل تجربة
أنزيم علم حركة
دراسات وظيفيّة من البروتين
دراسات إنشائيّة - بما في ذلك بروتين تبلور, بروتين بنية و [نمر].
أنت يستطيع أيضا استعملت البروتين أن يجعل أجسام لتجربة بعيد.

هناك اثنان [مين سستم] للتعبير من بروتين [ركمبيننت]. ما إن أنت تحصل [كدنا] ك يستنسخ, أنت ينبغي قرّرت حيث أنت تريد أن ضخّم بروتينك. هذا سيكون إمّا [بروكروتيك] (جرثوميّ) أو [إيوكروتيك] (عادة خميرة أو ثدّييّة خلية) نظامة. سيقرّر الإختبار من نظامتك الذي متّجه أنت ستحتاج أن يستنسخ [كدنا] ك داخل بما أنّ هناك يكون مادّة حفّازة مختلفة أيّ يعمل في [إ.كلي] وأخرى أنّ يعمل على أحسن وجه مع خميرة أو نظامات ثدّييّة.

هكذا أيّ بروتين تعبير نظامة يريد أنت استعملت?

نظامات لبروتين تعبير

[بروكروتيك] بروتين تعبير نظامات

[بروكروتيك] [ركمبيننت] بروتين تعبير يتلقّى نظامات عدّة ميزة. هذا يتضمّنون سهولة الثقافة, وسريعة خلية حالة نموّ معنى جدّا أنت لن تضطرّ انتظرت طويلا أن يحصل بروتين من نظامات جرثوميّ ما إن أنت تستنسخ [كدنا] ك. تعبير يستطيع كنت حثثت بسهولة في جرثوميّ بروتين تعبير نظامات يستعمل [إيبتغ]. أيضا, تطوير الى حدّ بعيد بسيطة في [بروكروتيك] تعبير نظامات وهناك وفرة من عدّة تجاريّة يتوفّر ل [ركمبيننت] بروتين تعبير.

[أن ث ون هند], إن أنت تحتاج أن يستعمل بروتيناتك لوظيفيّة أو دراسات أنزيميّ نظامات [بروكروتيك] مشكلة بما أنّ كثير بروتينات يصبحون غيرقابل للحلّ في تضمّن أجسام وجدّا يصعب أن يستردّ كبروتينات وظيفيّة. علاوة على ذلك, لا يضاف أكثر [إيف نوت] كلّ تعديل [بوست-ترنسلأيشنل] بجرثوم ولذلك بروتينك الفائدة يمكن لا يكون وظيفيّة. دراسات أنزيميّ لذلك يمكن كنت [أونفرويتفول].

[إيوكروتيك] تعبير نظامات

[إيوكروتيك] ليس مورثات حقّا "[أت هوم]" في خلايا [بروكروتيك], [إفن وهن] هم عبّر عن تحت التحكّم من المتّجه [بروكروتيك]. واحدة سبب أنّ [إ.] [كلي] يميّز خلايا غالبا البروتين منتوج من يستنسخ مورثات [إيوكروتيك] كدخيل ويدمّرهم. آخر أنّ لا يوفي [بروكروت] ال نفسه أنواع من [بوستّرنسلأيشنل] تعديل مثلما [إيوكروت] يتمّون. مثلا, عبّر عن بروتين أنّ عادة كنت زوّجت إلى [سوغرس] في خلية [إيوكروتيك] كنت كبروتين عامّة عندما يستنسخ في جرثوم. هذا يستطيع أنجزت بروتين نشاط أو إستقرار, أو على الأقلّ إستجابته إلى أجسام. أكثر مشكلة جدّيّة أنّ ليس الداخلية من خلية جرثوميّ بما أنّ مسبّبة إلى طي مناسبة من بروتينات [إيوكروتيك] كالداخلية من خلية [إيوكروتيك]. غالبا, طويت النتيجة مناسبا, منتوج غير فعّال من يستنسخ مورثات.

[إيوكروتيك] يتضمّن نظامات للتعبير البروتين:

خميرة
[ممّلين سلّ]
[بكلوفيروس] خلايا (حشرة)

كلّ هذا نظامات نظامات عظيمة [إيوكروتيك] للتعبير من بروتينات [ركمبيننت].
يتضمّن ميزة من [إيوكروتيك] بروتين تعبير نظامات الحقيقة أنّ أنت يستطيع حصلت مستويات عامّة تعبير جدّا. البروتينات يتيح أن ييصفّي يستعمل بطاقات خاصّ أيّ يكون مدرجة داخل المتّجه بما في ذلك خاصّتي, [مك] وأخرى بطاقات.

أنت يستطيع حتّى اشتريت [بلسميد] أيّ يفرز بروتينك داخل الأوساط. لذلك أنت يستطيع حافظت ينمو نظامتك ويجمع الأوساط دون [لز] خلاياك. هناك ما من تضمّن أجسام أن يقلق حوالي ويتلقّى بروتيناتك تعديل مصونة [بوست-ترنسلأيشنل]. هذا حيويّ إن أنت يكون تدرس العمل من بروتين [أند/ور] [بروتين-بروتين] تفاعل.

يتضمّن السيئة من [إيوكروتيك] بروتين تعبير نظامات الحقيقة أنّ خلايا [إيوكروتيك] ينموون بطيئة من خلايا [بروكروتيك].

تعبير متّجه مع مادّة حفّازة قوّيّة

العمل رئيسيّة من تعبير متّجه أن ينتج المنتوج من [جن-] عادة, ال كثير منتوج الجيّدة. لذلك, تعبير جهّزت متّجه عادة مع مادّة حفّازة قوّيّة جدّا; التفسير سبب أنّ ال كثير [مرنا] أنّ يكون أنتجت, سيجعل ال كثير بروتين منتوج كنت.
واحدة هذا مادّة حفّازة قوّيّة ال [ترب] ([تربتوفن] [أبرون]) مادّة حفّازة. هو يشكّل الأساس ل عدّة تعبير متّجه, بما في ذلك [بتربل1]. هو يتلقّى [ترب] مادّة حفّازة/مشغّل منطقة, يتبع ب [ريبوسم] [بيندينغ ست], ويستطيع كنت استعملت مباشرة كتعبير متّجه ب يدخل مورثة أجنبيّ داخل [كلي] موقعة. بالتّعاقب, ال [ترب] تحكّم منطقة يستطيع كنت جعلت "قابل للنقل" ب يقطع هو خارجا مع [كلي] و [هيندييي] ويدخل هو أمام مورثة أن يكون عبّر عن في آخر متّجه

قابل للحثّ تعبير متّجه

هو عادة [أدفنتجووس] أن يحافظ يستنسخ مورثة [ربرسد] إلى أن نحن يتأهّب أن عبّر عن هو. واحدة سبب أنّ بروتينات [إيوكروتيك] ينتج في كميات كبير في جرثوم يستطيع كنت مسمّة. [إفن يف] هذا بروتينات ليسوا واقعيّا مسمّة, يستطيع هم [بويلد وب تو] أوخ مستويات عظيمة أنّ هم يتدخّلون مع حالة نموّ جرثوميّ. في إمّا حالة, إن ال يستنسخ مورثة كان سمحت أن يبقى يلتفت فوق باستمرار, [غروو تو] الجرثوم يحمل المورثة أبدا عظيمة بكفاية تركيز أن ينتج كميات ذو معنى من بروتين منتوج. الحلّ أن يحافظ ال يستنسخ مورثة يلتفت باتّجاه آخر ب يضع هو [دوونسترم وف] مادّة حفّازة قابل للحثّ أنّ يستطيع كنت التفتت باتّجاه آخر.
الصمغ لكّ مادّة حفّازة قابل للحثّ [تو ا سرتين إكستنت], فرضا متبقّي باتّجاه آخر حتّى يحثّ بالاصطناعيّة محثّ [إيسبروبلثيوغلكتوسد] ([إيبتغ]). مهما, القمع يسبّب بالصمغ لكّ [ربرسّور] ناقص, وسيلاحظ بعض تعبير من ال يستنسخ مورثة كنت حتّى في [ث بسنس] المحثّ. [أن-وي] حول هذا مشكلة أن عبّر عن مورثتنا في [بلسميد] أو [فجميد] أنّ يحمل ه خاصّة [لس] مورثة, بما أنّ [ببس] يتمّ. أنتج ال [ربرسّور] زائدة ب هذا متّجه كتيف دعمنا يستنسخ مورثة يلتفت باتّجاه آخر إلى أن نحن يتأهّب أن يحثّ هو مع [إيبتغ].
آخر إستراتيجية أن يستعمل مادّة حفّازة [تيغتلي كنترولّد] ك ال λ مادّة حفّازة [فج] [بل]. تعبير استنسخت متّجه مع هذا مادّة حفّازة/مشغّل نظامة داخل [هوست سلّ] يحمل [تمبرتثر-سنستيف] λ [ربرسّور] مورثة ([ك1857]). [أس لونغ س] يحافظ نحن الدرجة حرارة من هذا خلايا نسبيّا منخفضة ([32ك]), ال [ربرسّور] يعمل, وما من تعبير يتمّ. مهما, عندما يرفع نحن الدرجة حرارة إلى المستوى [نونبرميسّيف] ([42ك]), ال [ربرسّور] [تمبرتثر-سنستيف] يستطيع [نو لونجر] عملت وال يستنسخ مورثة حثثت.

تعبير متّجه أنّ ينتج انصهار بروتينات

عندما كثير تعبير يشغل متّجه, هم ينتجون انصهار بروتينات. هذا أمكن في أولى بدات سيئة لأنّ ال [نتثرل برودوكت] من ال يدخل مورثة يكون لا يجعل. مهما, ال [أمينو سد] إضافيّة على الانصهار بروتين يستطيع كنت مساعدة عظيمة في ييصفّي البروتين منتوج.

يتلقّى اعتبرت ال [أليغ-هيستيدين] تعبير متّجه, واحدة [أف وهيش] ال [ترد نم] [بترشس]. هذا يتلقّون تسلسل قصير فقط [أوبسترم وف] ال يتعدّد استنساخ موقعة أنّ يرمّز إمتداد من ستّة هستدينات. لذلك, سيكون بروتين عبّر عن في هذا متّجه انصهار بروتين مع ستّة هستدينات في نهايته أمينيّة. لماذا نحن أردنا أن يربط ستّة هستدينات إلى بروتيننا? [أليغ-هيستيدين] يتلقّى مناطق مثل هذا انجذاب عامّة لمعلنات مثل نيكل, لذلك نحن يستطيع صفّيت بروتينات أنّ يتلقّى هذا مناطق يستعمل نيكل انجذاب عمليّة فصل لونيّ. الجميل من هذا طريقته بساطة وسرعة. عقب قد جعل الجرثوم الانصهار بروتين, نحن ببساطة [لز] هم, يضيف ال [سرود] مقتطف جرثوميّ إلى نيكل انجذاب عمود, يغسل خارجا كلّ بروتينات [أونبووند], بعد ذلك يطلق الانصهار بروتين مع هستدين أو هستدين متناظر يدعى [إيميدزول]. يسمحنا هذا إجراء أن يحصد أساسا انصهار صافية في فقط واحدة خطوة. هذا يمكن لأنّ جدّا قليل إن أيّ بروتينات طبيعيّ يتلقّون [أليغ-هيستيدين] مناطق, لذلك نا انصهار بروتين يكون أساسا الوحيدة واحدة أنّ يقيّد إلى العمود.

ماذا إن نحن نريد نا [بروتين-فر] من ال [أليغ-هيستيدين] بطاقة?

يزوّد المصمّم من هذا متّجه يتلقّى [ثووغتفولّي] طريق أن يزيل هو. [جوست بفور] ال يتعدّد استنساخ موقعة, هناك [كدينغ] منطقة لإمتداد ال [أمينو سد] يميّز ب ال [بروتيولتيك] أنزيم [إنتروكينس]. هكذا نحن يستطيع استعملت [إنتروكينس] أن يفرج الانصهار بروتين داخل اثنان جزء: ال [أليغ-هيستيدين] بطاقة والبروتين نحن نريد. الموقعة يميّز ب [إنتروكينس] جدّا نادر, والفرصة أنّ يتواجد هو في بروتيننا هيّنة. لذلك, بروتيننا سوفت لا يكون شطرت فوق بما أنّ نحن يكون نزيل ه [أليغ-هيستيدين] بطاقة. إن نحن نريد, نحن يستطيع ركضت ال [إنتروكينس-كلفد] بروتين من خلال النيكل عمود مكرّر أن يفصل ال [أليغ-هيستيدين] [فرغمنتس] من البروتين الفائدة.

λ يخدم [فج] يتلقّى أيضا كالأساس لتعبير متّجه; واحدة يصمّم خصوصا [ثيس بوربوس] [غت11]. يحتوي هذا [فج] صمغ لكّ تحكّم منطقة يتبع ب ال [لكز] مورثة. الاستنساخ حدّدت موقعات ضمن ال [لكز] مورثة, لذلك منتوج من مورثة يدخل داخل هذا متّجه سيكونون انصهار بروتينات مع زعيمة ال [ب-غلكتوسدس].
التعبير قد أصبح متّجه [غت11] عربة شعبيّة ل يجعل ويحجب [كدنا] مكتبات. [غت11] يسمحنا أن يحجب مجموعة من يستنسخ مباشرة للتعبير من ال صحّ بروتين. العنصر رئيسيّة يتطلّب ل هذا إجراء [كدنا] مكتبة في [غت11] ومصل مضادّ يوجّه ضدّ البروتين الفائدة.
نحن نيصفّي نا λ [فج] مع مختلفة [كدنا] ملحقة ويلطّف البروتينات يطلق ب كلّ أنسوخ على دعم مثل [نيتروسلّولوس]. ما إن نحن قد [ترنسفرّد] البروتينات من كلّ لوح معدنيّ إلى [نيتروسلّولوس], يسبر نحن مع مصل مضادّنا. بعد ذلك, يفتّش نحن جسم يحدّ إلى بروتين من لوح معدنيّ خاصّ, يستعمل يعلّب بروتين [ا] من [ستفلوككّوس-وريوس]. يقيّد هذا بروتين بإحكام إلى جسم ويعلّب ال يماثل بقعة على ال [نيتروسلّولوس]. نحن نكشف هذا علامة مميّزة بتصوير إشعاعيّ ذاتيّ أو ب [فوسفوريمجنغ], بعد ذلك يذهب إلى لوحتنا رئيسيّة والتقط ال يماثل لوح معدنيّ. لاحظت أنّ نحن يكشف انصهار بروتين, لا البروتين من فائدة بنفسي. علاوة على ذلك, لا يهمّ هو إن نحن قد استنسخنا [كدنا] كاملة أو لا. مصل مضادّنا خليط الأجسام أنّ سيتجاوب مع عدّة جزء مختلفة من بروتيننا, هكذا حتّى مورثة متحيّز سيتمّ, [أس لونغ س] ه [كدينغ] استنسخت منطقة في ال نفسه توجيه وقراءة إطار بما أنّ ال [ب-غلكتوسدس] [كدينغ] منطقة.

رأيت لسريعة [ركمبيننت] بروتين تعبير مراجعة:

[ركمبيننت] بروتين نظامات