كفلت/أعلنت & اقترنت إلى نا & اتّصل بنا & حول نا & ساعدتنا

علم الأحياء جزيئيّة [بلوغ]

أخيرة ساحة موقعات

 

حصر أنزيم هضم

حصر أنزيمات

©2006 محطة جزيئيّة

معلومة على كيف أن يصبح خبيرة على حصر أنزيمات ويهضم [دنا]!

خلفيّة على حصر أنزيمات

حصر أنزيمات (أو حصر [إندونوكلس]) أنزيمات أنّ يقطع [دنا] [دووبل-سترندد] ب يجعل اثنان كسور ، واحدة من خلال كلّ من الفسفات عمود فقريّ من اللولب مزدوجة. يتمّ الأنزيم هذا دون يضرّر الأسس من ال [دنا]. رغم أنّ الأنزيم يكسر ال [دنا] ، الروابط كيميائيّ يستطيع كنت أصلحت بأخرى أنزيمات يعرف ك [دنا] أنزيم رابط. لذلك ، حصر [فرغمنتس] ال [دنا] من مختلفة صبغيّات أو مورثات يستطيع كنت ربطت معا ، يزوّد نهاياتهم متمّمة.

فائدة من حصر أنزيمات في علم الأحياء جزيئيّة

الحقيقة أنّ [دنا] استطاع كنت عالجت ومختلف [دنا] قطعات استطاع الآن كنت حبكت معا ، [أبن وب] [أرا وف رسرش] جديدة أبدا قبل يتخيّل. يعتمد كثير من الطرق في علم الأحياء جزيئيّة اليوم على حصر أنزيمات. "استنتجت حصر" من الحقيقة أنّ هذا أنزيمات كان [إينيتلّي] اكتشفت في [إ.] [كلي] أيّ ظهر أن يكون قيّدت التلوث من ملتهم جراثيم خاصّة ("حميات" من جراثيم). هو صدقت حصر أنزيمات [هوست دفنس] آلية يتطوّر بجراثيم وأخرى كائن حيّ أن يقاوم تلوثات فيروسيّة ، وأن يساعد مع الإزالة من تسلسل فيروسيّة.

في 1978 ، منحت ال [نوبل بريز] لالطبّ كان إلى ويرنر [أربر] ، دانييل [نثنس] وهاملتون [سميث] لإكتشافهم من حصر [إندونوكلس] ، أيّ يقود إلى التطوير ال [دنا تشنولوج]. كان الإستعمال أولى عمليّة من حصر أنزيمات في علم والطبّ المعالجة من [إ.] [كلي] جراثيم أن عبّر عن أنسولين [ركمبيننت] إنسانيّ لمريض السكّري.

 

يعالج ويستعمل حصر أنزيمات

عيّنت وحدة من حصر [إنزم كتيفيتي] بالمبلغ من [رستريأيشن] أنزيم يتطلّب أن يقطع 1 ميكروغرام من ملتهم جراثيم [لمبدا] [دنا] إلى إنجاز في وقت من 1 ساعة.

فحوصات يطوّر بالصاحب مصنع من الأنزيمات [موست ليكلي] يتمّ يستعمل جدّا يصفّى [دنا] ([إي.] [بلسميد] أو [لمبدا] [دنا] [فج]) كطبقة سفليّة ، ويكيّف فحص أنّ ينتج النتيجات جيّدة مع تحضيرهم خاصّة. غالبا المختبرة ليس شروط بما أنّ مثاليّة ، وتجاوز خفيفة من أنزيم أو طويلة حضانة فترة استعملت أن يساعد ضمنت هضم كاملة.

هناك كثير "عالميّة" أنزيم مصدات أيّ سيعمل مع تشكيل الأنزيمات ، غير أنّ غالبا لا يلتقي هم المتطلبات فعّالة أكثر ل أيّ واحدة أنزيم. لأنّ المصدات عالميّة ليسوا بما أنّ فعّالة ، لا يوصي نحن إستعمالهم روتينيّة في المختبرة (خصوصا ل [دنس] معقّدة [جنوميك] ؛ ملخصات من [دنس] معقّدة [جنوميك] عادة في عال [دنا] تركيزات أيّ سيمنع الأنزيم ؛ أيضا ، الخام [دنا] [بربس] نسبيّا يمكن احتويت صادّ أيّ يتطلّب كثير وحدات أنزيم [أرد] طويلة حضانة أوقات لهضم كاملة). هو دائما جيّدة أن يستعمل الصاحب مصنع يوصى فحص شروط ل [رستريسأيشن] هضم. قد استنسخ بعض صاحب مصنع أنزيمات أيّ يتلقّى متطلبات مختلفة جدّا من أخرى صيغ من ال نفسه أنزيم ، لذلك يفحص قبل يستعمل. أنزيم أعطيت تركيزات دائما على الجانب من الأنزيم أنابيب. حصر خزّنت أنزيمات يستعمل في المختبرة دائما في -20 درجات [ك] (في سكرولات قاعدة) ، وسوفت كنت حافظت بما أنّ [كلوس تو] -20 درجات [ك] بما أنّ يمكن أن يمدّد الحياة من الأنزيم. أحضرت عندما [ستّينغ-وب] ملخصات ، الردّ فعل أنابيب إلى الأنزيم مجلد في [إيس بوكت] ؛ أزلت الأنزيم أنابيب من المجلد وحافظت الأنابيب على جليد بينما يعمل مع الأنزيم. فورا رجعت الأنابيب إلى المجلد عندما ينهي. استعملت ال [بيبتمن] يعيّن لحصر أنزيمات فقط ودائما يستعمل طرف طازجة [بيبتمن] عندما يزيل أنزيم من الأنابيب مبتذلة.

 

أطراف على حصر أنزيم إستعمال

• يزوّد كلّ صاحب مصنع من حصر أنزيمات مصدات خاصّة مع الأنزيمات ، وهذا سوفت كنت خزّنت في ال [-20ك] مجلد. حصر أنزيمات سوفت أيضا كنت خزّنت في [-20ك.].
• أبدا اصطلحت حصر ملخصات مع الحصر أنزيم يؤلّف أكثر من 1/10 من الحجم نهائيّة. هذا واجبة إلى الحقيقة أنّ الحصر خزّنت [إنزم بروتين] في سكرولات. في تركيزات فوق 10% ، يمنع سكرولات ليس فحسب الهضم غير أنّ أيضا يستطيع سبّبت نجم نشاط - يقود إلى شاذّة ، قطعات [نون-سبسفيك] من ال [دنا].
• ثبتت فوق تحكم ملخص عندما يستعمل حصر أنزيمات. هذا يساعد أنت عرفت إن الأنزيم يكون يعمل بشكل صحيح وأنت تثبت الردّ فعل فوق جيّدا. استعملت [بلسميد] [دنا] أيّ يلد يعرف تشظية أساليب.
• حددت عندما يعدّ مزدوجة أنزيم ملخصات ، ال [سلت كنتنت] من المصدات. أوصلت حصر هضم يستعمل الأنزيم مع ال [لوور] ملح متطلبات أولى ، بعد ذلك استعملت الثاني أنزيم ب يكيّف الردّ فعل أنابيب مصد إلى الثاني أفضل ملح تركيز.
• [دنا] تحضيرات يمكن يتلقّى شوائب أيّ يستطيع منعت حصر أنزيم هضم نشاط. بعض [دنا] عمليّة عزل يستعمل عدد حتّى عال [إدتا] مصدات أن يستخلص ال [دنا]. هذا [أك] ل [دنا] تخزين ، غير أنّ تركيزات عال [إدتا] يستطيع منعت حصر هضم. [بكر] ييصفّي [دنا] ك ويستخلص مع [ت] أو يروي إن [إنزم كتيفيتي] ك يكون منعت غير أنّ ك [دنا] نظرات [أك]. أنت استطاع أيضا أضفت [مغ2] إلى الردّ فعل ورأيت إن أنّ مساعدات أيضا.
• إن أنت يستطيع لا ينال كاملة حصر هضم من [دنا] ك بعد يضيف أنزيم إضافيّة ، يثبت فوق ملخص جديدة وأضفت [سبرميدين] إلى تركيز نهائيّة من 2 [مّ].

حصر أنزيم هضم ال [دنا]

 

تحليليّة ضدّ [بربرتيف] حصر أنزيم هضم

عادة [دنا] أوصلت هضم في 25 - 50 [أول] ([ميكروليتر]) ، عندما أنت فقط تريد أن يفحص أو حللت [دنا] ك. هذا دعات تحليليّة حصر أنزيم هضم.

واحدة يستطيع هضمت 0.25 [تو] 2 [أوغ] (ميكروغرام) لتحضيرات تحليليّة. هذا لأنّ على [أغروس] [مينيجل] ([30مل]) ، واحدة يستطيع تخيّلت تقريبا [.05وغ] (50 [نغ] ، [ننوغرم]) لكلّ نطاق. يعتمد تصور من نطاق على الطول من ال [دنا] والمبلغة من [دنا] هدية. [إين جنرل,] الطويلة ال [دنا] حاضرة في النطاق ، ال يتيح سيكون أن يرى.

 

[دنا] هضم من كثير ميكروغرام وحجوم [هيغر] من 50 - 500 [أول] ([ميكروليتر]) أو أكثر [بربرتيف] ، يعني أنّ يعدّ أنت [دنا] [فرغمنتس] لتطهير لاحقة ويستنسخ.

 

حصر هضم من [دنا] بروتوكول

وصفة لحصر أنزيم هضم:

تحليليّة

[10إكس] حصر أنزيم مصد استعملت هذا مخططة	10 [أول]
[دنا] (كثير ميكروغرام ال [دنا])	"[إكس]" [أول] [دنا] 20 أو كثير [أول]
ماء [ده2و] ([ميلّيبور] أو يعقّم)	86 - [إكس] [أول]
حصر أنزيم (10-20 [أو])	4 [أول]
مجموعة	100 [أول]

 

أنت أمكن أضفت [مغ2] إلى الهضم ردّ فعل ([إين ث فورم وف] [مغكل]) إن أنت تستعمل [لرج فولوم] من [دنا]. أنت سوفت أتمّت هذا خصوصا إن المصد أنت استخلصت [دنا] ك في يحتوى [إدتا]. هذا لأنّ إن "[إكس]" يكون كبيرة ، [إي]>[20ول] حجم ، أنت يمكن احتجت أن يضيف [مغ]. [إدتا] يقيّد إلى 4 عميلات ال [مغ] ل كلّ عميلة ال [إدتا]. لذلك ، سيقيّد [دنا] في 1 [مّ] ([ميليمولر]) حل ال [إدتا] [4مّ] من [مغ]. [رول وف ثومب] جيّدة أن يضيف 1 [1ول] من [10مّ] [مغكل] إلى كلّ [20ول] من [دنا].

 

[بربرتيف]

[10إكس] حصر أنزيم مصد استعملت هذا مخططة	5 [أول]
[دنا]	"[إكس]" [أول] [دنا] 0.25 [تو] 10 [أول]
ماء [ده2و] ([ميلّيبور] أو يعقّم)	43 - [إكس] [أول]
حصر أنزيم (10-20 [أو])	1 [أول]
مجموعة	50 [أول]

حضنت في [37ك] ل 1 - 3 ساعات.

1 وحدة بما فيه الكفاية أنزيم إلى [ديجست1] [أوغ] [دنا] على الأقلّ في 1 ساعة. يهضم ل 3 ساعات أنت استطاع هضمت مبلغات [هيغر] [دنا]. بما أنّ أنت يكون تضيف 10-20 وحدات الأنزيم ، أنت استطاع حتّى هضمت [10وغ] من [دنا] في 1 ساعة! أنزيمات غالية لا يبدّدهم [نيدلسّلي]!

بطاقات على أنزيم إستعمال:

• حافظت أنزيمات باردة.
• دائما حافظت حصر أنزيمات على جليد!
• قلّدت الوقت أنت تتلقّى حصر أنزيمات على جليد. أنت يستطيع أتمّت هذا بسهولة ب يشتري [كلد بوإكس] (أيّ يكون أساسيّا قالب المعدنة أنت تحافظ أنزيماتك داخل)

 

مراجع:

[سمبرووك] ، [ج.] ، [فريتسكه] ، [إ.ف.] ، و [ت.] [منيتيس]. (1989) استنساخ جزيئيّة ، مختبرة دليل استخدام. ثاني طبعة. باردة نابض مينة مختبرة [برسّ.] [بّ] 5.3 - 5.32.

اقترنت إن هذا بروتوكول كان مفيدة ، رجاء إلى نا!

©2006 محطة جزيئيّة